魔芋葡甘低聚糖對大鼠腸道環境的影響

王 敏，帥天罡，秦清娟，鐘 耕,2,

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400716）

魔芋葡甘低聚糖對大鼠腸道環境的影響

王 敏1，帥天罡1，秦清娟1，鐘 耕1,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400716）

目的：研究以半干法酶解制備的魔芋葡甘低聚糖（konjac oligosaccharides，KOS）對大鼠腸道環境的影響。方法：將KOS摻入到飼料中飼喂Sprague-Dawley（SD）大鼠，30 d后測定大鼠盲腸內容物各項指標和盲腸、小腸的理化指標。結果：KOS可以明顯增加大鼠糞便含水率及盲腸壁表面積、小腸的拉伸性能、盲腸內容物中雙歧桿菌和乳酸菌的數量；降低盲腸內容物pH值及含水率、游離氨及揮發性醛類和含氮類物質含量；抑制大腸桿菌和梭狀芽孢桿菌的生長，增加短鏈脂肪酸的產生量。結論：KOS可以調節大鼠腸道菌群組成，改善腸道環境，促進腸道健康，是一種優良的益生元。

魔芋葡甘低聚糖；腸道環境；盲腸內容物；益生元

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）又被稱為魔芋多糖，是從魔芋塊莖中提取的儲備性多糖［1-2］。它是由D-甘露糖和D-葡萄糖按物質的量比1.6∶1或1.69∶1通過β-1，4糖苷鍵聚合成的［3］。KGM具有良好的吸水性、成膜性、增稠性、可塑性、乳化性、結構性、保水性和賦形性等多種性質［4-5］，其獨特的流變和凝膠性能使其在功能性食品領域被廣泛應用［6-7］。同時它還具有提高機體免疫力、清潔胃腸道、減肥、降血脂、防止糖尿病、抗衰老等多種生理功效［8］。但目前KGM的應用也存在較大問題，如KGM相對分子質量較高，黏度大，難以工業化生產，因此選取一種優良工藝，獲取利于應用的產品成為了人們關注的焦點。

魔芋葡甘低聚糖（konjac oligosaccharide，KOS）味微甜，有魔芋特有的香味，且口感純正。有研究者通過實驗得出KOS對致病菌如金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌有明顯抑制作用［9］，并能抑制淀粉老化、清除自由基、對益生菌如乳酸菌有促進和增殖作用［10-11］。目前，KOS的制備方法主要集中在物理法［12-13］、化學法［14-15］和生物酶法［16-17］。本實驗擬采取半干酶法制備KOS，即以β-甘露聚糖酶處理KGM，通過微波加熱滅酶制備KOS。該方法具有反應條件溫和、污染小、能耗低、得率高、提純方法簡單等特點［18］，并且避免了KGM相對分子質量大、黏度高、溶解度小等缺陷。

有研究表明，在體外發酵實驗中KOS表現出良好的腸道益生性能，明顯增加腸道益生菌數量和短鏈脂肪酸含量［18］，而其在動物體內能否表現出這種功能尚且不知。因此，本實驗以Sprague-Dawley（SD）大鼠為受試體，研究KOS對其腸道環境的影響，為KOS作為益生元及其進一步開發利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級SD大鼠80 只，體質量（180f10）g，大鼠及飼料均購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，許可證號：SCXK（渝）2012-0003；動物房溫度22～25 ℃，每天12 h明暗輪換（7：00ü19：00），實驗動物環境設施合格證：普通級環境。

KOS粉末為自制［19-20］，外觀呈粉狀，白色，無臭無味，易溶于水，不溶于乙醇、乙醚等有機溶劑；經液相色譜和飛行質譜聯用分析，可推導出該低聚糖是一種吡喃型葡甘露低聚糖。該低聚糖中相對分子質量最小的為甘露二糖，最大的為甘露十糖，表明該KOS粉末為葡甘二糖～葡甘十糖及少量單糖的混合物［21］。

乙酸、丙酸、丁酸、正戊酸、異戊酸（色譜純）阿拉丁試劑（上海）有限公司；RR820A熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM、9763 DNA提取試劑盒日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設備

HH-4數字恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；JTI0001電子天平 上海精天電子儀器有限公司；DHG-9070A電熱鼓風干燥箱 上海奇欣科學儀器有限公司；DSC4000差示掃描量熱儀 美國Perkin Elmer公司；DHR-1流變儀 美國TA公司；MVAG803202微型快速黏度儀 德國Brabender GmbH公司；CT-3質構儀美國Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理

健康SD大鼠80 只，隨機分為4 組，每組20 只，雌雄各半。兩只同性別的大鼠放于一籠，自由進食進水，普通飼料預養1 周，觀察實驗動物對環境的適應情況。將含低（0.625 g/（kg·d））、中（1.250 g/（kg·d））、高（2.500 g/（kg·d））3 個不同劑量KOS粉碎樣品的飼料分別給予3 組大鼠，另設給予不含樣品的同種飼料的空白對照組。連續喂養30 d，自由進水，待實驗結束后斷頭處死大鼠，解剖測定相關指標。

1.3.2 大鼠糞便含水率測定

實驗開始后，每周的后3 d收集空白對照組和KOS不同劑量組大鼠糞便，稱量各組大鼠新鮮糞便質量。然后將大鼠糞便放入60 ℃鼓風干燥箱中干燥12 h，按照公式（1）計算糞便含水率［22］。

1.3.3 盲腸物理指標測定

1.3.3.1 盲腸內容物質量測定

取出盲腸，稱量盲腸總質量，計為m1；刮出盲腸內容物，用無菌生理鹽水清洗腸壁，稱取盲腸壁凈質量，計為m2；按照公式（2）計算盲腸內容物質量。

1.3.3.2 盲腸壁表面積測定

參照劉慶慶等［23］的方法：將清洗干凈的盲腸壁完全展開固定到A4紙上，勾出其輪廓，待紙完全干燥后將盲腸壁輪廓復印到打印紙上，然后將紙上的盲腸壁輪廓圖剪切下來，稱量其質量，計為m3；另外準確稱取25 cm2打印紙質量，計為m4，按照公式（3）計算盲腸壁表面積。

1.3.3.3 盲腸內容物pH值測定

取新鮮盲腸內容物于去離子水處理過的離心管中，加入10 倍質量的去離子水（V/m），放于漩渦振蕩器上混合均勻，靜置，用精密pH計測定上清液的pH值。

1.3.3.4 盲腸內容物含水率測定

取0.3 g左右盲腸內容物，放于恒質量的稱量皿中，放于60 ℃鼓風干燥箱中干燥12 h，計算烘干前后盲腸內容物質量的差值［22］，按公式（4）計算盲腸內容物含水率。

1.3.4 盲腸內容物游離氨含量測定

標準曲線的繪制：稱取1.004 5 g無水NH4Cl溶于800 mL蒸餾水中，用稀釋的鹽酸調節pH值至2.0，再用蒸餾水定容至1 L，即質量濃度320 mg/L的貯備液。用貯備液配制成320、160、80、40、20、10、0 mg/L的標準溶液，制作標準曲線［24］。

取0.5 g盲腸內容物加入10 倍質量的蒸餾水（V/m），漩渦振蕩器混合均勻，4 000 r/min離心后取上清液40 μL，依次加入2.5 mL含有0.001 mol/L亞硝基鐵氰化鈉的0.500 mol/L苯酚溶液、2 mL含有0.625 mol/L氫氧化鈉的0.030 mol/L次氯酸鈉溶液。將上述混合液混勻，60 ℃保溫5 min，于625 nm波長處測定吸光度（A625nm）。

1.3.5 盲腸內容物短鏈脂肪酸含量的測定

準確稱取各組大鼠盲腸內容物0.5 g，溶于5 mL蒸餾水中，將其放到漩渦振蕩儀上使盲腸內容物呈均勻懸浮液，靜置10 min，4 000 r/min離心10 min。移取2 mL上清液于5 mL離心管中，加入2 mL無水乙醚，混勻，密封，于4 ℃冰箱中靜置30 min，使乙醚和發酵液分層。移取上層乙醚溶液，過0.45 μm濾膜，用于有機酸的測定。

參照賈益群等［25］的方法測定大鼠盲腸內容物中的短鏈脂肪酸含量：用氣相色譜法測定發酵液中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸及總酸含量。其中總酸含量為以上各種酸含量的總和。取乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸及異戊酸制備標準品貯備液，再按6 個稀釋梯度的標準液制作標準曲線。

氣相色譜條件：進樣量1 μL；進樣口溫度220 ℃；柱流量0.95 mL/min，柱溫90 ℃、平衡時間0.5 min，以5 ℃/min的速率升溫至150 ℃，保留時間7 min；檢測器溫度230 ℃；氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量40 mL/min。

1.3.6 盲腸內容物微生物數量測定

1.3.6.1 細菌基因組DNA提取

分別取各組大鼠盲腸內容物0.3 g，用5 mL無菌磷酸鹽緩沖溶液稀釋，3 000 r/min低速離心5 min，取上清，12 000 r/min離心3 min，棄上清液。按照DNA提取試劑盒說明書進行細菌基因組總DNA提取，提取的DNA經微量紫外分光光度計測得A260nm/A280nm為1.8～2.0，說明DNA純度較高，可以作為熒光定量PCR的DNA模板。

1.3.6.2 熒光定量PCR

盲腸內容物中微生物數量的測定采用SYBR GreenⅠ染料法，在定量PCR儀上進行。反應體系：SYBR GreenⅠ染料10 μL、上下游引物1 μL、DNA模板4 μL，最后以雙蒸水補足20 μL；反應程序：95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40 個循環。循環結束后進行熔解，熔解程序：95 ℃ 5 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 0.1 ℃/s降溫至65 ℃。用定量PCR得出的Ct值，采用2-ΔΔCt法［26］計算大腸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌、梭狀桿菌、乳酸菌的相對數量，相關引物見表1。其中－ΔΔCt=（Ct目標菌－Ct總細菌）實驗組－（Ct目標菌－Ct總細菌）對照組。不同細菌DNA引物見表1。

表1 細菌DNA引物對照表Table 1 Bacterial DNA primers used in fluorescence quantitative PCR

1.3.7 盲腸內容物揮發性成分含量測定

盲腸內容物中揮發性成分含量采用氣相色譜-質譜聯用儀測定［27-28］：在20 mL樣品瓶中加入0.5 g盲腸內容物，加入5 mL無菌緩沖溶液，在漩渦振蕩器上振蕩均勻，于60 ℃條件下頂空萃取30 min，250 ℃解吸5 min。

氣相色譜-質譜條件：毛細管柱DB-5MS（30 mh0.25 μm，膜厚0.25 μm）；柱升溫程序：起始溫度40 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至140 ℃，再以3 ℃/min升至155 ℃，保持1 min，然后以2 ℃/min升至190 ℃，保持1 min，最后以25 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；汽化室溫度：250 ℃；載氣（He）流速：1.0 mL/min；進樣方式：不分流進樣。

1.3.8 小腸物理性質測定

小腸長度測定：將整段小腸（從胃根部算起，下至盲腸根部）剪下，自然拉直，用米尺測量小腸長度。

小腸系數測定：用分析天平測定小腸凈質量，按照公式（5）計算大鼠小腸系數。

小腸拉伸性能采用質構儀測定：取下小腸中段10 cm，用于測定拉伸性。質構儀參數設定如下：探頭TA3/100，夾具TA-RT-KIT，觸發點負載0.02 N，測試速率0.5 mm/s，100%形變。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 大鼠糞便含水率變化

實驗過程中，各組大鼠糞便形狀、大小均一，無黏連或稀便現象。其中KOS低、中劑量組大鼠糞便較其他各組表面更顯光滑。如圖1所示，各組大鼠在實驗第1～4周內糞便含水率變化不大。比較各組可以發現，KOS各劑量組大鼠糞便含水率均高于空白對照組，其中雌性大鼠的KOS低、中劑量組和雄性大鼠的KOS中劑量組（第2～4周）糞便含水率均顯著高于空白對照組（P＜0.05）。以上結果說明飼喂KOS可增加大鼠糞便含水率。

圖1 KOS對大鼠糞便含水率的影響Fig.1 Effect of KOS on fecal moisture content from rats

2.2 大鼠盲腸物理指標變化

表2 KOS對大鼠盲腸內容物質量、盲腸壁凈質量和盲腸表面積的影響（）Table 2 Effect of KOS on cecal content weight, cecal wall weight and cecal wall area in rats ()

表2 KOS對大鼠盲腸內容物質量、盲腸壁凈質量和盲腸表面積的影響（）Table 2 Effect of KOS on cecal content weight, cecal wall weight and cecal wall area in rats ()

注：*.與空白對照組（相同性別）相比差異顯著（P＜0.05）。表6同。

指標 大鼠性別 空白對照組 KOS低劑量組KOS中劑量組KOS高劑量組盲腸內容物質量/g雌 1.37f0.13 1.41f0.14 1.51f0.16 1.48f0.14雄 1.53f0.26 1.56f0.19 1.57f0.17 1.46f0.21盲腸壁凈質量/g雌 22.24f1.64 25.21f1.24*24.45f1.06*26.64f1.50*雄 24.33f1.57 28.63f1.77*28.82f1.71*27.86f1.73*雌 0.73f0.12 0.77f0.10 0.72f0.09 0.82f0.13雄 1.06f0.18 0.93f0.10 1.02f0.18 0.93f0.15盲腸壁表面積/cm2

由表2可知，各組大鼠盲腸內容物質量和盲腸壁凈質量均無顯著差異（P＞0.05），而KOS各劑量組大鼠的盲腸壁表面積均顯著大于空白對照組（P＜0.05）。這可能是由于KOS對小鼠腸道產生了刺激作用，增大了盲腸壁表面積，加強了大鼠盲腸對營養物質的吸收所致。

2.3 大鼠盲腸內容物pH值變化

腸道pH值是腸道健康的一個重要指標。如圖2所示，KOS各劑量組大鼠盲腸內容物pH值較空白對照組均有所降低，且隨著KOS劑量的增加，大鼠盲腸內容物pH值呈現先降低后升高的趨勢，其中KOS中劑量組大鼠盲腸內容物pH值最低。KOS各劑量組大鼠盲腸內容物pH值均下降的現象與KOS體外發酵實驗結果趨勢一致［18］，即KOS可以降低盲腸內容物pH值。

圖2 KOS對大鼠盲腸內容物pH值的影響Fig.2 Effect of KOS on pH of cecal contents in rats

2.4 大鼠盲腸內容物含水率變化

如圖3所示，比較發現，雌、雄兩個性別大鼠的盲腸內容物含水率均在45%以上，KOS各劑量組大鼠盲腸內容物含水率明顯低于空白對照組，且隨著KOS劑量的增加，大鼠盲腸內容物含水率先降低后稍有增加，在雌、雄兩個性別大鼠中都有此規律。

2.5 大鼠盲腸內容物游離氨含量變化

游離氨是造成腸道內容物氣味、對腸道健康不利的主要物質。如圖4所示，KOS各劑量組大鼠盲腸內容物中游離氨含量顯著低于空白對照組（P＜0.05），但KOS高劑量組大鼠盲腸內容物中游離氨含量卻有升高的趨勢，原因目前尚不明確，還有待進一步研究。由此可以看出KOS可以顯著降低盲腸中游離氨含量，這正好與盲腸內容物pH值變化趨勢吻合。

圖4 KOS對大鼠盲腸內容物游離氨含量影響Fig.4 Effect of KOS on the free ammonia content of cecal contents in rats

2.6 大鼠盲腸內容物中微生物數量變化

如表3所示，KOS各劑量組大鼠盲腸內容物中乳酸菌和雙歧桿菌數量均顯著高于空白組（P＜0.05），且隨著KOS劑量的增加，乳酸菌和雙歧桿菌數量均呈現出先增加后降低的趨勢。而梭狀芽孢桿菌和大腸桿菌數量均顯著降低（P＜0.05），且與乳酸菌和雙歧桿菌呈現相反的趨勢；而KOS各劑量組大鼠盲腸內容物中擬桿菌數量與空白對照組均無顯著差異（P＞0.05）。KOS對大鼠腸道乳酸菌、雙歧桿菌和梭狀芽孢桿菌的作用與體外發酵結果一致[18]，而對大腸桿菌的影響不同，這可能是因為體外發酵條件難以控制，從而造成的實驗誤差較大所致。

表3 KOS對盲腸內容物微生物相對數量的影響（x±s，n=10）Table 3 Effect of KOS on bacterial counts in cecal contents in rats (x± s,n= 10)

2.7 KOS對大鼠盲腸內容物短鏈脂肪酸含量的影響

表4 KOS對大鼠盲腸內容物中短鏈脂肪酸含量的影響（x±s，n=10）Table 4 Effect of KOS on cecal SCFAs in rats (x± s,n = 10) mmol/g

如表4所示，在飼料中添加KOS后，雌、雄大鼠盲腸中乙酸和戊酸含量均顯著升高（P＜0.05），且隨著KOS劑量的增加呈現先升高后降低的趨勢，這與腸道益生菌數量的變化趨勢相同；同時也使大鼠盲腸中丙酸和丁酸含量顯著增加（P＜0.05），且變化趨勢與KOS添加量成正相關。KOS各劑量組大鼠盲腸中總酸含量顯著高于空白對照組（P＜0.05），且與乙酸含量具有相同的變化趨勢，KOS中劑量組總酸含量最高，這與體外發酵實驗結果趨勢一致［18］。

2.8 大鼠盲腸內容物揮發性物質種類和含量變化

如表5所示，共檢測出醛類、酮類、醇類和吲哚類總計15 種揮發性物質，還有部分烷烴類。其中變化最明顯的是吲哚類物質，與空白對照組相比，攝入KOS的大鼠盲腸內容物中吲哚的相對含量明顯降低。另外，有較大變化的揮發性物質還有月桂醇、豆蔻醇、肉豆蔻醛和香葉基丙酮等。這種現象同樣與體外發酵實驗揮發性物質測定結果相符［18］，由此可以推斷KOS可以減少大鼠盲腸中刺激性物質的產生。

表5 KOS對大鼠盲腸內容物揮發性物質含量的影響（x±s，n=10）Table 5 Effect of KOS on the volatile substance contents of cecal contents in rats (x± s,n= 10) %

腸道中的游離氨、揮發性物質中的吲哚等有害物質主要是由腸道中有害菌的生長代謝產生。KOS抑制了大鼠腸道中有害菌的生長，從而減少了盲腸內容物中游離氨和吲哚的含量。

2.9 大鼠小腸物理性質變化

表6 KOS對大鼠小腸物理性質的影響（x±s，n=10）Table 6 Effect of KOS on small intestinal parameters in rats (x± s,n= 10)

如表6所示，KOS各劑量組大鼠的小腸系數和小腸長度變化不明顯，而小腸拉伸性均高于空白對照組，其中雄性KOS高劑量組和雌性KOS中劑量組與空白對照組相比存在顯著差異（P＜0.05），但是不存在明顯的劑量-效應關系。上述結果表明KOS可以增加小腸的拉伸性能。目前，小腸黏膜下基質（small intestinal submucosa，SIS）作為一種新型的生物衍生支架材料正在得到更多關注。SIS在心血管、泌尿系統、胃腸類等管狀組織的治療的恢復中有良好作用。但SIS作為一種組織工程化血管生物材料，必須具有適當的力學特性如彈性，才能保證其植入宿主體內后提供暫時的機械支撐力。因此增強小腸的拉伸性能可為新材料的應用提供有利條件［29-30］，而本實驗結果表明KOS具有增加大鼠小腸拉伸性能的良好作用。

3 結 論

本實驗通過測定大鼠糞便含水率，盲腸壁凈質量、表面積，盲腸內容物質量、pH值、游離氨含量、短鏈脂肪酸含量、微生物數量、揮發性物質種類和含量等項目檢測KOS對大鼠腸道健康的影響，結果表明KOS可以明顯增加大鼠糞便含水率，降低盲腸內容物pH值和含水率；增加大鼠盲腸壁表面積，加強小腸的拉伸性能；增加大鼠盲腸內容物中雙歧桿菌和乳酸菌的數量、短鏈脂肪酸的產生量，抑制大腸桿菌和梭狀芽孢桿菌的生長；降低大鼠盲腸內容物中游離氨及揮發性含氮類物質含量。

此外，從大鼠盲腸內容物pH值、短鏈脂肪酸含量、微生物數量和揮發性物質含量等指標的變化趨勢可以看出，KOS體內實驗和體外發酵實驗結果趨勢基本相同。由此可以推斷，KOS可以調節大鼠腸道菌群組成，改善腸道環境，促進腸道健康，是一種優良的益生元。

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Effect of Konjac Oligosaccharides on Rat Intestinal Environment

WANG Min1， SHUAI Tiangang1， QIN Qingjuan1， ZHONG Geng1，2，*
（1. College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China；2. Chongqing Engineering Research Center of Regional Food， Chongqing 400716， China）

Objective： To evaluate the effect of konjac oligosaccharides （KOS）， prepared by semi-drying enzymatic hydrolysis， on the rat intestinal environment. Methods： The cecal contents， cecal parameters and small intestinal parameters of Sprague-Dawley rats were measured to evaluate the safety of KOS after 30 days of dietary incorporation with KOS. Results： KOS could significantly increase the moisture content of rat feces and the surface area of the cecum wall， the tensile strength of the small intestine， the total amounts of beneficial bacteria such as Bifidobɑcterium spp.， Lactobacillus and reduce pH and moisture， volatile aldehydes and nitrogenous substances contents of the cecal contents. In addition， KOS inhibited the growth of Escherichia coli and Bacterium fusiformis and increased the total amount of short-chain fatty acids （SCFAs）. Conclusion： KOS can adjust the intestinal microflora， improve the intestinal environment and promote intestinal health as an excellent prebiotic.

konjac oligosaccharides （KOS）； intestinal environment； cecal contents； prebiotic

10.7506/spkx1002-6630-201607036

TS201.4

A

1002-6630（2016）07-0197-07

王敏， 帥天罡， 秦清娟， 等. 魔芋葡甘低聚糖對大鼠腸道環境的影響［J］. 食品科學， 2016， 37（7）： 197-203. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201607036. http：//www.spkx.net.cn

WANG Min， SHUAI Tiangang， QIN Qingjuan， et al. Effect of konjac oligosaccharides on rat intestinal environment［J］. Food Science， 2016， 37（7）： 197-203. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201607036. http：//www.spkx.net.cn

2015-05-13

重慶市“121”科技支撐示范工程項目（cstc2014zktjccxyyBX0032）；重慶市前沿與應用基礎研究計劃一般項目（cstc2014jcyjA80040）

王敏（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：414008142@qq.com

*通信作者：鐘耕（1964—），男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂、植物蛋白。E-mail：zhongdg@126.com