響應面試驗優化烏梅熊果酸提取工藝及其對大腸桿菌的抑制作用

周 茜，韓 雪，韓曉梅，閆晨靜，白冰瑤，王唯霖，趙 文*

（河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000）

響應面試驗優化烏梅熊果酸提取工藝及其對大腸桿菌的抑制作用

周 茜，韓 雪，韓曉梅，閆晨靜，白冰瑤，王唯霖，趙 文*

（河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000）

采用響應面法優化超聲提取烏梅熊果酸的最佳條件。在單因素試驗基礎上，選擇乙醇體積分數、料液比和超聲時間為影響因素，以烏梅熊果酸提取量為響應值進行響應面分析；并研究了烏梅熊果酸對大腸桿菌的抑制作用。結果表明，烏梅熊果酸提取最佳工藝條件為乙醇體積分數71%、料液比3∶44（g/mL）、超聲時間2.5 h，在此條件下提取量為（12.61±0.13）mg/g。烏梅熊果酸對大腸桿菌最低抑菌濃度為0.25 mg/mL；高劑量組（0.5 mg/mL）處理后與對照組相比，細胞壁和細胞膜通透性增加，培養液蛋白質含量、核酸大分子物質含量、Ca2+濃度和總漏出率分別增加了28、1.5、7 倍和0.8 倍；掃描電鏡觀察菌體有明顯變形或破碎現象，表明烏梅熊果酸對大腸桿菌生長具有抑制作用。

烏梅；熊果酸；響應面分析法；大腸桿菌；抑菌作用

周茜， 韓雪， 韓曉梅， 等. 響應面試驗優化烏梅熊果酸提取工藝及其對大腸桿菌的抑制作用［J］. 食品科學， 2016， 37（8）: 67-73. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608012. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Qian， HAN Xue， HAN Xiaomei， et al. Optimization of ursolic acid extraction from Fructus Mume and evaluation of its antibacterial activity against Escherichia coli［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 67-73. （in Chinese with English abstract）DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608012. http://www.spkx.net.cn

烏梅，又稱酸梅、合漢梅，是梅果主要加工產品之一。梅是我國的一種特種資源，目前世界上僅在韓國、日本、新西蘭等少數國家人工栽培，其他國家和地區相對罕見。烏梅使用歷史悠久，具有斂肺澀腸、生津止渴、驅蟲止痢等功效，《神農本草經》中列為中品，是我國重要的藥食同源物品［1］。研究［2］表明，烏梅中含有多種活性物質，包括有機酸、萜類、黃酮、酯類等，其中熊果酸是烏梅發揮藥理作用的有效成分之一。熊果酸具有抗炎癥、降血糖及免疫增強效果等多種生物學活性［3-5］。Zhang Tingting等［6］研究表明熊果酸可以通過抑制Toll量受體介導的炎癥途徑及改善機體氧化應激作用，對實驗性早期腦損傷起到保護作用。日本等國家已經將其作為天然抗氧化劑應用于食品中，具有廣闊的應用前景和重要的開發利用價值［7］。

目前烏梅熊果酸的相關研究較少。王娟［8］采用乙醇提取烏梅熊果酸并進行響應面法優化，熊果酸提取量為6.57 mg/g。紀曉花［9］對烏梅熊果酸抑菌效果進行初步研究，結果表明其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等4 種致病菌具有顯著抑菌作用。但是烏梅熊果酸提取量較低，制約了其生物活性的深入研究。因此本研究采用超聲輔助提取烏梅熊果酸并進行響應面試驗優化，獲得最佳提取條件，提高烏梅熊果酸提取量；并從細胞膜和細胞壁通透性、蛋白質含量、細胞內容物及菌體形態等方面研究烏梅熊果酸對大腸桿菌的抑菌作用，以期為熊果酸及烏梅資源的綜合利用提供可靠的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

烏梅購于河北省保定萬寶堂藥房，60 ℃恒溫烘箱中烘干，多功能高速粉碎機粉碎，60 目過篩備用。

熊果酸對照品 中國食品藥品檢定研究院；香草醛、無水乙醇、高氯酸、冰乙酸（均為分析純） 天津市百納化工有限公司；營養瓊脂、酵母浸粉、瓊脂粉北京奧博星生物技術有限責任公司；牛肉浸膏、蛋白胨北京雙旋微生物培養基制品廠；實驗用水為蒸餾水。

大腸桿菌（Escherichia coli）保存于河北農業大學微生物實驗室。

1.2儀器與設備

BL-100型高速多功能粉碎機 浙江省永康市松青五金工具廠；TU-1910紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；電子天平 常州稱重設備系統有限公司；SB-5200DTDN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SPX-150S-Ⅱ型生化培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；DDS-307A （DDB-600）型電導儀 上海精密科學儀器公司。

1.3方法

1.3.1烏梅熊果酸含量的測定［10-11］

1.3.1.1熊果酸標準溶液的配制

精密稱取干燥至質量恒定的熊果酸標準品20.00 mg，置于50 mL容量瓶中，無水乙醇定容，獲得質量濃度為400 μg/mL的標準溶液。準確吸取2.5 mL標準品溶液，定容至10 mL，即得質量濃度為100 μg/mL的熊果酸對照品，待用。

1.3.1.2標準曲線繪制

準確吸取熊果酸標準品0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0 mL，分別置于試管中，85 ℃水浴鍋中揮干溶劑，加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.3 mL，搖勻；加入高氯酸1.0 mL，搖勻；60 ℃水浴溫育15 min，后置于冰水冷卻至室溫；加入冰乙酸5.0 mL，搖勻后放置15 min顯色，以空白試劑為參比，測定546 nm波長處吸光度。以熊果酸標準品含量（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制熊果酸標準曲線并得到回歸方程為：y=0.006 4x-0.013 2，相關系數R2=0.999 5。

1.3.1.3烏梅量品中熊果酸含量測定

準確吸取0.3 mL烏梅量品提取液，參照1.3.1.2節方法，測定456 nm波長處的吸光度。根據回歸方程計算烏梅熊果酸質量。烏梅熊果酸提取量以單位烏梅質量（g）含有的熊果酸質量（mg）計算。

1.3.2烏梅熊果酸取工藝流程

烏梅（干燥）→粉碎→不同條件下超聲輔助浸提→離心→過濾→定容→測定吸光度→濃縮干燥→提取量計算

1.3.3烏梅熊果酸提取單因素試驗

1.3.3.1乙醇體積分數對提取效果的影響

準確稱取烏梅量品3.0 g共4 份，固定料液比3∶30（g/mL）、超聲時間2 h、超聲溫度50 ℃，考察乙醇體積分數為50%、60%、70%、80%、90%條件下烏梅熊果酸提取量。

1.3.3.2料液比對提取效果的影響

準確稱取烏梅量品3.0 g共4 份，乙醇體積分數用1.3.3.1節中選定的條件，固定超聲時間2 h、超聲溫度50 ℃，考察料液比為3∶20、3∶30、3∶40、3∶50、3∶60（g/mL）條件下烏梅熊果酸提取量。

1.3.3.3超聲時間對提取效果的影響

準確稱取烏梅量品3.0 g共4 份，乙醇體積分數用1.3.3.1節中選定的條件，料液比用1.3.3.2節中選定的比例，固定超聲溫度50 ℃，考察超聲時間為0.5、1、2、3、4 h條件下烏梅熊果酸提取量。

1.3.3.4超聲溫度對提取效果的影響

準確稱取烏梅量品3.0 g共4 份，乙醇體積分數用1.3.3.1節中選定的條件，料液比用1.3.3.2節中選定的比例，超聲時間用1.3.3.3節中選定的時間，考察超聲溫度為30、40、50、60、70 ℃條件下烏梅熊果酸提取量。

1.3.4烏梅熊果酸提取響應面試驗優化［12-13］

在單因素試驗結果基礎上，選取乙醇體積分數（X1）、料液比（X2）、超聲時間（X3）為自變量，以烏梅熊果酸提取量為響應值，根據響應面Box-Behnken試驗設計原理，對烏梅熊果酸提取的影響因素進行深入研究和條件優化，并做出響應面圖，對響應面受多個變量影響的因素進行建模分析。試驗設計因素與水平見表1。

表1　Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.5烏梅熊果酸對大腸桿菌的抑制作用

依照響應面分析確定的最優條件提取烏梅熊果酸。提取液5 000 r/min離心10 min，取上清液，經大孔凝膠樹脂純化后，回收洗脫液冷凍干燥即得烏梅熊果酸粉末。配制相應質量濃度溶液進行大腸桿菌抑制作用研究。

1.3.5.1最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定

采用瓊脂平板稀釋法測定烏梅熊果酸的MIC值［14］。將烏梅熊果酸倍比稀釋，使其在培養基中終質量濃度為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL，分別取1 mL加入培養皿中，倒入15 mL培養基，充分混勻。待冷卻凝固后，均勻涂布100 μL 104CFU/mL的對數生長期大腸桿菌菌懸液，37 ℃恒溫培養24 h，觀察菌落生長情況。以無菌落生長的最低烏梅熊果酸稀釋含量為MIC。

1.3.5.2烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞膜通透性的影響

將培養至對數期的大腸桿菌，分別加入烏梅熊果酸使其終質量濃度為MIC和2MIC，37 ℃、150 r/min繼續培養。分別于0、2、4、6、8 h時取量，3 500 r/min離心10 min，取上清液，用電導儀測定其電導率［15］。以不含烏梅熊果酸的菌懸液為對照，重復3 次，取平均值。

1.3.5.3烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞壁通透性的影響

分別于0、2、4、6、8 h時取1.3.5.2節中實驗組與對照組菌懸液，3 500 r/min離心10 min，取上清液，用試劑盒測定堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）的活性［16］，重復3 次，取平均值。

1.3.5.4烏梅熊果酸對大腸桿菌培養液蛋白質含量的影響

分別于0、2、4、6、8 h時取1.3.5.2節中實驗組與對照組菌懸液，采用Bradford［17］方法測定菌液中蛋白質含量，重復3次，取平均值。

1.3.5.5烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞內容物含量的影響

分別取1.3.5.2節中實驗組與對照組培養8 h菌懸液10 mL于離心管中，分別測定核酸大分子物質含量、Ca2+濃度及總漏出率［18］。核酸大分子物質含量測定：4 000 r/min離心5 min，取上清液，測定260 nm波長條件下的吸光度；Ca2+濃度測定：依照鈣試劑盒說明書測定上清液中Ca2+濃度；總漏出率測定：測定上清液600 nm波長條件下的吸光度。重復3 次，取平均值。

1.3.5.6掃描電鏡觀察

分別取1.3.5.2節實驗組與對照組菌懸液各5 mL，8 000 r/min 離心5 min收集菌體，2.5%戊二醛溶液固定4 h，磷酸緩沖液洗滌，依次使用體積分數50%、70%、90%和100%乙醇溶液對菌體進行脫水處理30 min。將脫水菌體涂片于蓋玻片上，自然風干，放入高真空蒸發器中，噴金鍍膜，掃描電鏡觀察細菌表面形態［19-20］。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

圖1A結果顯示，乙醇體積分數在50%～70%范圍內，烏梅熊果酸提取量呈現上升趨勢，且乙醇體積分數達到70%時提取量最高；但當乙醇體積分數大于70%時，提取量下降，提取溶劑的極性降低，可能會導致熊果酸溶解度下降，而其他脂溶性雜質溶出量增加，影響烏梅熊果酸提取量，因此選擇70%的乙醇溶液作為提取溶劑。圖1B顯示，料液比在3∶20～3∶40的范圍內，烏梅熊果酸提取量顯著增加，且料液比為3∶40時最高；但當溶劑用量繼續增加時，烏梅熊果酸提取量下降；當提取溶劑過少時，固液兩相濃度梯度小，使熊果酸有效物質不能完全溶出；而溶劑過多會造成溶劑浪費并對后續分離純化步驟不利，因此選擇3∶40為最適提取料液比。圖1C結果顯示，在2 h內，提取量隨超聲時間延長而增高，2 h時達到最大；但繼續延長超聲時間，提取量開始下降并且趨于平穩，故選定2 h為最佳提取時間。圖1D結果顯示，提取量隨超聲溫度升高而平緩增加，但沒有顯著性差異，故超聲溫度對烏梅熊果酸提取的影響較小。

2.2響應面試驗與結果

2.2.1回歸模型的建立及方差分析

在單因素試驗結果基礎上，選擇乙醇體積分數（X1）、料液比（X2）、超聲時間（X3）為自變量，進行三因素三水平的響應面試驗設計，試驗設計與結果見表2。

利用Design-Expert 7.0軟件對表2數據進行多元回歸量合分析，獲得以烏梅熊果酸提取量為響應值的回歸方程：Y=11.77+0.36X1+0.44X2+0.35X3-0.36X1X2+ 0.14X1X3+0.10X2X3-1.07X12-0.51X22-0.60X32。

由表3可知，模型P=0.000 6＜0.01（極顯著），失量項P=0.189 4＞0.05（不顯著），說明此模型與試驗有較好的量合性，試驗誤差較小。相關系數R=0.956 9和調整系數=0.900 6也表明模型量合程度較好，總變異系數為2.63%，說明重現性較好，該模型可用于優化烏梅熊果酸提取工藝條件。從各個因素顯著性水平差異可知，對烏梅熊果酸提取量影響大小為：料液比＞乙醇體積分數＞超聲時間。乙醇體積分數、料液比一次項和乙醇體積分數、料液比、超聲時間的二次項對烏梅熊果酸提取量的影響達到了極顯著水平（P＜0.01）；超聲時間一次項影響顯著（P＜0.05）；交互項X1X2對烏梅熊果酸提取量具有顯著影響（P＜0.05）；而其他因素交互作用不顯著。

表3　烏梅熊果酸提取優化回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2響應面分析

根據回歸方程得出不同因素的響應面和等高線，結果見圖2。

圖2　各因素交互作用對提取量影響的響應面Fig.2 RSM analysis for interactive effects of ethanol concentration，solid-to-solvent ratio and sonication time on extraction efficiency

從圖2a可知，曲面比較陡峭，說明乙醇體積分數、料液比對提取量影響都顯著；同時等高線是橢圓形，說明交互作用也非常顯著；當乙醇體積分數比較低時，提取量隨料液比變化不明顯；當乙醇體積分數在70%～72%之間時，提取量隨著溶劑用量增加而顯著提高，且能達到最大值。由圖2b可知，雖然乙醇體積分數和超聲時間單因素對提取量影響顯著，但兩者交互作用不顯著（P=0.371 6），響應面圖曲面相對陡峭，等高線圖接近圓形；從等高線圖中還可看出，保持乙醇體積分數不變，超聲時間太長不利于烏梅熊果酸提取；當超聲時間大于2.5 h時，提取量開始降低。由圖2c可知，料液比和超聲時間交互作用（P=0.492 1）不顯著；當料液比在3∶44之后時，提取量降低；同時，乙醇體積分數和料液比的交互作用與料液比和超聲時間的交互作用相比，前者等高線更接近于橢圓形，其對提取量作用比后者顯著。

2.2.3驗證實驗結果

根據回歸方程預測烏梅熊果酸超聲提取最優工藝條件為乙醇體積分數71%、料液比3∶44、超聲時間2.5 h，該優化條件下烏梅熊果酸提取量預測12.58 mg/g。為證明試驗結果與實際情況是否相符，以上述優化條件做3 次平行，得到烏梅熊果酸提取量為（12.61±0.13）mg/g，與預測值無顯著性差異，說明此響應面法得到的回歸模型具有一定的可靠性。與王娟［8］研究結果相比，烏梅熊果酸提取量增加1 倍，具有較好應用前景。

2.3烏梅熊果酸的抑菌作用

2.3.1烏梅熊果酸對大腸桿菌的MIC

表4　烏梅熊果酸對大腸桿菌的MIC測定結果Table 4 MIC of ursolic acid against E. coli

由表4可知，烏梅熊果酸對大腸桿菌的抑制效果明顯，MIC值為0.25 mg/mL。

2.3.2烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞膜通透性的影響

圖3　烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞膜通透性的影響Fig.3 Effects of ursolic acid on the cell membrane permeability of E. coli

當外界環境不利于微生物生長時，菌體細胞內K+、Na+等電解質大量外漏，導致培養液電導率改變，從而反映細胞膜滲透性情況，同時電解質離子的外漏導致細胞內多種代謝途徑受阻，嚴重影響細菌的正常生長［21-22］。由圖3可知，不同質量濃度烏梅熊果酸處理的大腸桿菌培養液電導率明顯高于對照組。隨著作用時間的延長，烏梅熊果酸處理的培養液電導率都呈現持續升高現象，且高質量濃度烏梅熊果酸處理組的電導率變化顯著。這說明烏梅熊果酸處理后大腸桿菌菌體細胞質發生滲漏，電解質滲出量不斷增大，細胞內環境穩定性被破壞，從而破壞菌體細胞，達到抑菌效果。

2.3.3烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞壁通透性的影響

圖4　烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞壁通透性的影響Fig.4 Effects of ursolic acid on the cell wall permeability of E. coli

AKP是存在于細胞壁與細胞膜之間的一種酶，正常情況下胞外液中檢測不到其活性。當細胞壁受到破壞后，透性增加，AKP會泄漏到胞液中，所以通過檢測細胞外AKP活性的變化可以反映細胞壁的通透性［23-25］。由圖4可知，隨著作用時間延長，不同質量濃度處理組的大腸桿菌培養液中AKP活性持續上升，當達到6 h時，活性達到最高值，隨后趨于平穩狀態，且活性高于對照組。說明烏梅熊果酸處理對大腸桿菌細胞壁有很強的破壞作用。

2.3.4烏梅熊果酸對大腸桿菌培養液蛋白質含量的影響

圖5　烏梅熊果酸對大腸桿菌蛋白質含量的影響Fig.5 Effects of ursolic acid on the protein content of E. coli

由圖5可知，不同質量濃度烏梅熊果酸對大腸桿菌培養液蛋白質含量具有顯著影響，當作用時間超過2 h時，蛋白質含量快速增加，6 h時達到最高，但隨著作用時間繼續延長，變化不大。當作用時間為6 h時，MIC、2MIC烏梅熊果酸處理及對照組的蛋白質含量分別為610.49、620.38、21.4 μg/mL，烏梅熊果酸顯著改變大腸桿菌細胞的膜透性，使細胞內的蛋白質滲漏到胞外培養液中。但MIC和2MIC烏梅熊果酸處理的差異不顯著。

2.3.5烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞內容物含量的影響

表5　烏梅熊果酸對大腸桿菌細胞內容物含量的影響Table 5 Effects of ursolic acid on the intracellular constituents of E. coli

如表5所示，大腸桿菌經烏梅熊果酸處理8 h后，不同處理組的核酸大分子物質含量、Ca2+濃度和總漏出率與對照組相比，均具有差異顯著性。不同質量濃度烏梅熊果酸處理的核酸大分子物質含量和總漏出率沒有顯著差異。高質量濃度烏梅熊果酸處理的Ca2+濃度顯著高于低質量濃度處理。

2.3.6掃描電鏡觀察結果

圖6 大腸桿菌的掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrograph of E. coli

圖6顯示，不同處理組大腸桿菌菌體都發生明顯變化。MIC烏梅熊果酸處理的大腸桿菌菌體邊緣模糊，菌體間界限不明顯，發生聚集現象；且菌體細胞表面粗糙，有凹陷和皺縮痕跡。2MIC烏梅熊果酸處理的大腸桿菌呈不規則狀態，菌體出現破碎，并伴隨有碎片產生。對照組大腸桿菌，菌體邊緣整齊、形狀規則，未發現明顯變化。說明烏梅熊果酸能夠有效抑制大腸桿菌的生長。

3　結 論

通過單因素試驗和響應面優化分析，影響烏梅熊果酸提取量大小的因素順序為料液比、乙醇體積分數和超聲時間，其中料液比與乙醇體積分數因素之間的交互作用顯著。通過響應面得到烏梅熊果酸提取最佳工藝條件為：乙醇體積分數71%、料液比3∶44（g/mL）、超聲時間2.5 h。在該優化條件下，烏梅熊果酸提取量為（12.61±0.13）mg/g。

烏梅熊果酸對大腸桿菌的MIC值為0.25 mg/mL，隨著烏梅熊果酸質量濃度增大，其抑菌效果也逐漸增強。經過0.5 mg/mL烏梅熊果酸處理后，大腸桿菌細胞壁、細胞膜通透性明顯增加，培養液中蛋白質含量、核酸大分子物質、Ca2+濃度和總漏出率分別增加了28、1.5、7 倍和0.8 倍，掃描電鏡觀察菌體有明顯變形或破碎現象。烏梅熊果酸主要是通過破壞菌體細胞壁和細胞膜的完整性，引起細胞內容物的外漏，從而發揮對大腸桿菌的抑制作用。

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Optimization of Ursolic Acid Extraction from Fructus Mume and Evaluation of Its Antibacterial Activity against Escherichia coli

ZHOU Qian， HAN Xue， HAN Xiaomei， YAN Chenjing， BAI Bingyao， WANG Weilin， ZHAO Wen*
（College of Food Science and Technology， Agricultural University of Hebei， Baoding 071000， China）

The conditions for ultrasound-assisted extraction of ursolic acid from Fructus Mume were optimized by response surface methodology （RSM）. Based on the results of single-factor tests， three factors including ethanol concentration， solidto-liquid ratio and extraction time were identified as main variables that affect extraction efficiency. Optimization of the three factors was performed using extraction efficiency of ursolic acid as the response. Besides， the antibacterial effect of ursolic acid on Escherichia coli was studied. The optimum extraction conditions were determined as follows: ethanol concentration， 71%； solid-to-liquid ratio， 3:44 （g/mL）； and extraction time， 2.5 h. Under these conditions， the yield of ursolic acid was （12.61 ± 0.13） mg/g. The antibacterial test showed that the minimal inhibition concentration of ursolic acid against E. coli was 0.25 mg/mL. After treatment with 0.5 mg/mL ursolic acid， the cell wall and membrane permeability of E. coli was increased and the contents of protein， nucleic acid materials， Ca2+and total leakage were enhanced by 29， 2.5， 8 and 1.8 folds compared to control， respectively. The scanning electron microscopic observation of E. coli showed that the cells were obviously destroyed or broken， indicating that ursolic acid has inhibitory effect on the growth of E. coli. The study can lay the theoretical basis for the application of ursolic acid and Fructus Mume in the future.

Fructus Mume； ursolic acid； response surface methodology； Escherichia coli； antibacterial effect

10.7506/spkx1002-6630-201608012

R284.5

A

1002-6630（2016）08-0067-07

2015-07-01

河北省科技計劃項目（13226602D）

周茜（1986—），女，講師，博士，研究方向為天然活性物質研究與食品安全。E-mail：zhouqianyz513@126.com

趙文（1962—），女，教授，碩士，研究方向為營養分析與食品安全。E-mail：13582820221@163.com

引文格式：