超聲輔助萃取-高效液相色譜同時測定益母草中8 種有效成分

陳軍華，周光明，*，鄧永利，秦紅英，彭貴龍，高 意，陳定軍

（1.西南大學 發光與實時分析教育部重點實驗室，重慶 400715；2.成都金建人民醫院藥劑科，四川 成都 610000）

超聲輔助萃取-高效液相色譜同時測定益母草中8 種有效成分

陳軍華1，周光明1，*，鄧永利1，秦紅英1，彭貴龍1，高 意1，陳定軍2

（1.西南大學 發光與實時分析教育部重點實驗室，重慶 400715；2.成都金建人民醫院藥劑科，四川 成都 610000）

目的：建立高效液相色譜法同時測定益母草中丁香酸、阿魏酸、蘆丁、大豆素、槲皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素8 種有效成分的方法。方法：采用InertSustain C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為甲醇（A）-0.1%乙酸溶液（B）；線性梯度洗脫；流速1.0 mL/min；紫外檢測波長285 nm；柱溫35 ℃；進量量20 μL。結果：該條件下8 種成分的分離度良好，標準曲線在線性范圍內呈良好線性，相關系數均不小于0.999 1（n=7）。加量回收率（n=3）平均值為89.93%～102.01%，相對標準偏差為1.17%～3.11%。結論：實驗結果表明本方法簡單、快速、準確，為藥用植物益母草的質量控制提供了實驗依據。

高效液相色譜；益母草；黃酮；有機酸；定量

陳軍華， 周光明， 鄧永利， 等. 超聲輔助萃取-高效液相色譜同時測定益母草中8 種有效成分［J］. 食品科學， 2016， 37（8）: 86-90. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608015. http://www.spkx.net.cn

CHEN Junhua， ZHOU Guangming， DENG Yongli， et al. Simultaneous determination of 8 active ingredients in Herba Leonuri by ultrasonic-assisted extraction coupled with high performance liquid chromatography［J］. Food Science， 2016，37（8）: 86-90. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608015. http://www.spkx.net.cn

益母草（Herba Leonuri）為唇形科植物（Leonurus japonicus Houtt）的新鮮或干燥地上部分，鮮品春季幼苗期至初夏花前期采摘；干品夏季莖葉茂盛、花未開或初開時采割，切斷曬干。其味辛、苦，性微寒，歸肝、心包、膀胱經，具有利尿消腫、活血調經的功效，用于治療瘡瘍腫毒、月經不調、痛經閉經、惡露不盡、水腫尿少等疾?。?］。目前已從益母草中分離得到黃酮類、多肽類、二萜類、生物堿類、芳香族化合物等成分［2-7］。目前國內外已有很多關于益母草的藥理和臨床應用的報道，如相關文獻對益母草在防治彌散性血管內凝血、治療急性腦梗死、痛經心肌缺血以及在婦產科中的應用進行了深入研究［8-12］；亦有報道［13］對益母草的種族藥理學、植物化學和藥物學進行了歸納總結，并且指出益母草中含有丁香酸、阿魏酸、蘆丁、大豆素、槲皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素等達140多種化學物質，其中的主要活性成分為生物堿、二萜類和黃酮類物質。亦有很多研究表明益母草具有抗氧化、緩解細胞凋亡和心肌衰弱的功效［14-17］。但是，目前關于益母草中有效成分定量分析的報道并不多，少量文獻報道了益母草中水蘇堿和益母草堿的分離和測定［18-24］，而鮮見對其中有機酸和黃酮的定量分析，如翁愛彬等［25］用高效液相色譜法僅測定了益母草中的蘆丁和槲皮素，叢悅等［26］高效液相色譜法也僅測定了其中的丁香酸和蘆丁。本實驗采用超聲輔助萃取前處理量品，具有操作簡單、萃取效率高和適用性廣的優點，另外超聲波萃取的工藝成本和能源消耗也較低。結合高效液相色譜法快速分離和測定了益母草中丁香酸、阿魏酸、蘆丁、大豆素、槲皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素8 種有效成分，為益母草藥材的進一步研究提供了實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

益母草 市購。丁香酸、阿魏酸、蘆丁、大豆素、槲皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素對照品（純度均不小于98.5%） 上海晶純實業有限公司；乙酸（分析純）、甲醇（色譜純） 重慶川東化工有限公司化學試劑廠；二次蒸餾水 實驗室自制。

1.2儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀（包括SPD-20A紫外檢測器、CTO-10AS柱溫箱、LC-20AT泵） 日本島津公司；KH-3200B型超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；SZ-2自動雙重純化水蒸餾器 上海瀘西分析儀器廠有限公司；XY型電熱恒溫干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；FA2004A型分析天平 上海精天電子儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1供試品溶液的制備

精密稱取益母草干燥粉末（過60 目篩）0.1 g，置于具塞錐形瓶中，準確加入80%甲醇溶液8 mL，稱定質量，超聲20 min（100 W，40 kHz），放冷，再稱定質量，用80%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，靜止，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

1.3.2對照品溶液的制備

精密稱定各對照品適量于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，分別配制成質量濃度為500.0 μg/mL丁香酸、530.0 μg/mL阿魏酸、1 000.0 μg/mL蘆丁、500.0 μg/mL大豆素、500.0 μg/mL槲皮素、500.0 μg/mL橙皮素、490.0 μg/mL山柰酚和320.0 μg/mL芹菜素的對照品溶液。分別精密吸取丁香酸和蘆丁對照品溶液各2.0 mL，阿魏酸、大豆素、槲皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素對照品溶液各1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成混合對照品溶液，置于冰箱（4 ℃）內避光保存備用。

1.3.3色譜條件

色譜柱：InertSustain C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇為流動相A，0.1%乙酸溶液（pH 3.0）為流動相B，梯度洗脫（0～5 min，45%～60% A；5～10 min，60%～60% A；10～15 min，60%～70% A；15～20 min，70%～45% A）；流速：1.0 mL/min；進量量：20 μL；檢測波長：285 nm；柱溫：35 ℃。混合對照品和量品的色譜圖見圖1。

圖1　混合對照品（A）和樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard mixture （A） and sample （B）

1.3.4標準曲線繪制

精密量取1.3.2節的混合對照品溶液，以甲醇逐步稀釋為7 個不同質量濃度的混合對照品溶液。不同質量濃度的混合對照品溶液按質量濃度由低到高的順序，在1.3.3節的條件下依次進量兩次進行分析。以對照品平均峰面積（mAU）為縱坐標Y，質量濃度（μg/mL）為橫坐標X作圖，并進行線性回歸。8 種化合物的線性關系考察結果見表1。

表1　8 種化合物的線性關系考察結果Table 1 Calibration curve equations with linear ranges for 8 compounds

2　結果與分析

2.1提取條件的優化

2.1.1流動相的選擇

分別考察甲醇-水、乙腈-水、乙醇-水作為流動相的分離效果，發現甲醇和水作為流動相時能夠有效分離。當甲醇-水（50∶50，V/V）等度洗脫時對照品能夠彼此分開，但是山柰酚和芹菜素的保留時間太長且峰形展寬，為了有效改善色譜峰展寬的現象同時是各成分達到完全分離，最終確定了1.3.3節中的梯度洗脫條件。同時本實驗進一步比較了不同pH值的流動相對分離效果的影響，當用pH 3的乙酸溶液代替純水時能有效改善色譜峰的前延和拖尾，故最終選擇甲醇和0.1%乙酸溶液（pH 3）作為流動相。

2.1.2提取溶劑的選擇

在考察了乙醇、環己烷和甲醇作為提取溶劑后，發現甲醇作為萃取溶劑的提取量明顯高于另外兩種溶劑。用乙醇和環己烷作為提取溶劑，在進量分析中可能與流動相甲醇存在溶劑效應導致了低的提取量，所以選擇甲醇作為提取溶劑。同時進一步考察了不同比例的甲醇-水溶液對有效成分提取量的影響，依次考察20%、40%、60%、80%和100%的甲醇體積分數對有效成分提取的影響。20%和40%甲醇體積分數提取溶劑可能與提取目標物的極性相差太大使得提取率不高，結果見圖2。

圖2　甲醇體積分數對提取量的影響Fig.2 Effect of methanol concentration on extraction efficiency

2.1.3超聲時間的影響

比較超聲提取10、20、30、40 min和50 min的提取量，超聲提取大于30 min時，部分有效成分的提取量逐漸減小，可能是過長的超聲時間破壞了浸出的有效成分，結果見圖3。

圖3　超聲時間對提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasound radiation time on extraction efficiency

2.1.4超聲功率的影響

圖4　超聲功率對提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasound power on extraction efficiency

考察不同超聲提取功率對8 種有效成分提取量的影響，由圖4可知，功率由80 W增至120 W時，各成分的提取量逐漸增大；提取功率大于120 W時，各成分的提取量稍有降低，故選擇120 W超聲功率進行后續的單因素試驗。

2.1.5固液比和波長的選擇

圖5　固液比對提取量的影響Fig.5 Effect of solid to liquid ratio on extraction efficiency

考察固液比為1∶20、1∶30、1∶50、1∶80和1∶100（g/mL）的提取效果，不同固液比對有效成分的提取量影響較大，或許是不同質量濃度的量品提取液導致了有效成分的浸出率，結果見圖5。根據8 種有效成分的最大吸收波長，綜合考慮含量較低成分的最大吸收強度，最終選擇285 nm作為檢測波長。

2.1.6正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗進一步優化實驗參數，選定甲醇體積分數、固液比、超聲時間和超聲功率4 個影響因素，各取3 個水平進行正交試驗。試驗中根據8 種活性成分的提取總量來評價萃取性能。正交試驗設計的結果及直觀分析見表2。由極差R可知，各因素對8 種活性成分提取總量的影響程度依次為B＞A＞D＞C，即固液比是影響提取總量的主要因素，甲醇體積分數和超聲功率次之，超聲時間的影響最小。比較k1、k2、k3的值可得提取8 種活性成分的最佳條件為A2B3C2D1，即甲醇體積分數80%、固液比1∶80、超聲時間30 min、超聲功率100 W。

表2　正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design with direct analysis of experimental results

2.2精密度實驗結果

混合對照品溶液在1.3.3節的條件下重復進量6 次，測定各個對照品的峰面積，結果丁香酸、阿魏酸、蘆丁、大豆素、槲皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素對照品的峰面積相對標準偏差均在0.63%～1.59%之間，表明儀器精密度良好。

2.3穩定性實驗結果

用同一供試品溶液48 h內每間隔6 h連續測定，結果8 種有效成分峰面積的相對標準偏差均在1.01%～2.52%之間，表明供試品溶液穩定性良好。

2.4重復性實驗結果

取同一批次益母草量品粉末5 份，按1.3.1節的步驟制備供試品溶液，進量分析，計算得到8 種有效成分峰面積的相對標準偏差（n=5）在1.19%～1.66%之間，表明儀器重復性良好。

2.5量品的含量測定及回收率實驗結果

按1.3.1節的步驟制備供試品溶液3 份，每份供試品溶液進量分析3 次，根據線性方程測定量品含量，結果見表3。精密稱取9 份0.1 g同一批益母草量品，分為3 組，每組按低、中、高分別加入一定量的對照品溶液，然后按照供試品溶液的制備方法進行處理，每組重復進量3 次，計算平均回收率，結果見表3。各成分加標回收率平均值為89.93%～102.01%，結果令人滿意；相對標準偏差為1.17%～3.11%，表明該分離測定方法相當穩定。

表3　樣品含量測定及加標回收率實驗（n=3）Table 3 Results of determination of real samples and spiked recoveries （n= 3）

3　結 論

本實驗利用高效液相色譜法結合紫外檢測器，實現了益母草中丁香酸、阿魏酸、蘆丁、大豆素、槲皮素、橙皮素、山柰酚和芹菜素的分離及測定，取得了滿意的效果。采用超聲萃取前處理量品，方法簡單、快速、經濟。分別考察了不同流動相、甲醇體積分數、萃取劑體積、超聲功率及時間對提取8 種有效成分的影響，為益母草藥材的進一步研究提供了實驗依據。

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Simultaneous Determination of 8 Active Ingredients in Herba Leonuri by Ultrasonic-Assisted Extraction Coupled with High Performance Liquid Chromatography

CHEN Junhua1， ZHOU Guangming1，*， DENG Yongli1， QIN Hongying1， PENG Guilong1， GAO Yi1， CHEN Dingjun2
（1. Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis， Ministry of Education， Southwest University，Chongqing 400715， China； 2. Chengdu People's Hospital of Jinjian， Pharmacy Department， Chengdu 610000， China）

Objective: To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the simultaneous determination of syringic acid， ferulic acid， rutin， daidzein， quercetin， quercetin， quercetin and quercetin in Herba Leonuri. Methods: The analytes were separated on an InertSustain C18（150 mm × 4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase consisted of methanol and 0.1% acetic acid （pH 3.0） with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min. The UV detection wavelength was set at 285 nm. The column temperature was maintained at 35 ℃. The injection volume was 20 μL. Results: The eight compounds were well separated， showing good linear correlations with correlation coefficient （r） ≥ 0.999 1 （n = 7）. The average recoveries were 89.93%-102.01%， with relative standard deviations （RSDs） between 1.17% and 3.11%. Conclusion: The method is simple， rapid and accurate， which can provide an experimental basis for quality control of Herba Leonuri.

high performance liquid chromatography （HPLC）； Herba Leonuri； flavonoids； organic acid； quantification

10.7506/spkx1002-6630-201608015

O657.72

A

1002-6630（2016）08-0086-05

2015-05-28

國家自然科學基金面上項目（21277110）；中央高?；究蒲袠I務費專項（100030-2120130993）

陳軍華（1989—），男，碩士研究生，研究方向為色譜分析。E-mail：chenjunh999@163.com

周光明（1964—），男，教授，博士，研究方向為色譜及其聯用技術。E-mail：gmzhou@swu.edu.cn

引文格式：