高效液相色譜-三重四極桿質譜法同時測定番茄中水楊酸和赤霉酸

李騰飛，趙風年，張 超，江澤軍，劉廣洋，王 靜，*，劉海金，徐 平，金茂俊，金 芬，邵 華，王珊珊，鄭鷺飛，佘永新，*

（1.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081；2.西藏自治區農畜產品質量安全檢驗檢測中心，西藏 拉薩 850000）

高效液相色譜-三重四極桿質譜法同時測定番茄中水楊酸和赤霉酸

李騰飛1，趙風年1，張 超1，江澤軍1，劉廣洋1，王 靜1，*，劉海金2，徐 平2，金茂俊1，金 芬1，邵 華1，王珊珊1，鄭鷺飛1，佘永新1，*

（1.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081；2.西藏自治區農畜產品質量安全檢驗檢測中心，西藏 拉薩 850000）

建立番茄中植物激素——水楊酸和赤霉酸的高效液相色譜-三重四極桿質譜檢測方法。量品經乙酸-乙腈提取，采用C18固相萃取柱凈化，C18色譜柱分離，0.5%甲酸-甲醇溶液作為流動相進行梯度洗脫，質譜采用電噴霧負離子模式電離，多反應監測模式定性，基質標準曲線外標法定量。水楊酸的響應值在1.25～20.00 ng/mL范圍內具有良好的線性關系，相關系數（R2）為0.998 4；赤霉酸的響應值在10～1 000 ng/mL范圍內呈良好的線性關系，相關系數（R2）為0.993 3，在3 個加標含量條件下，水楊酸（1.25、2.50、5.00 μg/kg）、赤霉酸（10.0、50.0、100.0 μg/kg）的回收率分別為87.6%～95.3%和83.8%～96.5%，相對標準偏差不高于6.9%，方法的檢出限分別為0.01、0.15 ng/mL。

水楊酸；赤霉酸；高效液相色譜-串聯質譜法；番茄

LI Tengfei， ZHAO Fengnian， ZHANG Chao， et al. Simultaneous determination of salicylic acid and gibberellic acid in tomato by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 182-186. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608032. http://www.spkx.net.cn

植物內源激素是植物體內合成的一系列結構不同的小分子有機化合物，既可調控植物自身的生長發育，又可通過與植物所生存的外部環境相互作用調節其對環境的適應［1-4］。由于植物內源激素在植物生命活動中發揮著重要作用，對其定量檢測已引起了廣泛的關注［5］。植物內源激素的檢測方法主要包括毛細管電泳法［6-7］、氣相色譜法［8］、高效液相色譜法［9-10］、氣相色譜-質譜聯用法［11-13］、液相色譜-質譜聯用法［14-17］等。

然而，植物內源激素在植物體內的含量很低（通常在μg/kg，甚至ng/kg水平），基體成分復雜，并且對溫度等外界條件敏感，在不同器官中呈現動態分布，這對其痕量、高靈敏度、精確定量檢測提出了更高要求［18-19］。液相色譜串聯質譜法具有很強的定性定量能力，是一種更為可靠地分析植物激素的方法［20-22］。水楊酸是一種小分子酚類物質，能夠誘導植物提高抗病性［23-24］；赤霉酸是一種四環二萜酸，可控制莖的伸長、打破種子休眠、控制開花和性別表達等［25-26］。目前對番茄中水楊酸和赤霉酸含量同時檢測的研究較少，本實驗建立一種高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用方法，對不同生長階段番茄中水楊酸和赤霉酸的含量進行了分析。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

水楊酸（純度為97.0%） 中國食品藥品檢定研究院；赤霉酸（純度99.0%） 德國Dr. Ehrenstofer公司；甲醇、乙腈、正己烷（均為色譜純） 美國Mreda科技公司；甲酸（色譜純） 迪馬公司；氨水、氯化鈉、無水硫酸鎂（均為分析純） 北京化工廠；其他試劑均為分析純；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2儀器與設備

1200液相色譜儀 美國Agilent Technologies公司；API 5000三重四極桿串聯質譜儀 美國AB Sciex質譜系統公司；高速勻漿機 德國Braun公司；高速冷凍離心機 美國Thermo科技公司；Vortex-Genie 2旋渦混合器美國Scientific Industries公司；MilliQ純水機 法國Millipore公司；TTL-DC II型氮吹儀 北京同泰聯科技發展有限公司；C18SPE（Sep-Pak Vac C18）小柱 美國Waters公司。

1.3方法

1.3.1量品前處理

1.3.1.1提取

用高速勻漿機破碎番茄量品后，稱取10 g試量（精確至0.01 g），于50 mL離心試管中，加入10 mL 含1%乙酸-乙腈溶液，劇烈振蕩1 min，加入4 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂，充分振蕩渦旋1 min，5 000 r/min離心5 min。

1.3.1.2凈化

分別用3 mL甲醇和水活化C18固相萃取柱，取1 mL用氨水調節pH值為8（氨水含量約體積分數5%）的上清液上量，用1 mL正己烷淋洗，3 mL含5%乙酸-甲醇溶液洗脫。將洗脫液氮吹至干，1 mL甲醇復溶，過0.22 μm有機濾膜，上機測定。

1.3.2液相色譜條件

色譜柱：XTerra?MS C18柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；進量體積5 μL；流動相：0.5%甲酸溶液（A）和甲醇（B）。洗脫梯度見表1；流速300 μL/min。

表1　梯度洗脫程序Table 1 Setting up of gradient elution program

1.3.3質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子模式；噴霧電壓：-4 500 V；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣壓：20 psi；碰撞氣壓：9 psi；霧化氣壓：40 psi；輔助氣壓：40 psi；射入電壓：-10 V；碰撞室出口電壓：-17 V；多反應離子監測模式；水楊酸和赤霉酸的定性離子對和定量離子對的去簇電壓、碰撞能量見表2。

表2　水楊酸和赤霉酸的母離子、子離子、去簇電壓及碰撞能量Table 2 Parent iron， product ion， declustering potential （DP）， collision energy （CE） of SA and GA3

2　結果與分析

2.1量品前處理條件優化

2.1.1提取溶劑的選擇

考察不同體積分數（0.1%、1%、5%）的乙酸-乙腈溶液對番茄中的水楊酸和赤霉酸提取效果，結果表明，以體積分數1%乙酸-乙腈溶液作為提取劑其提取效率最高，水楊酸和赤霉酸的回收率均可達83.8%以上，而單純有機溶劑的提取效率較差。因此，本方法選用體積分數1%乙酸-乙腈作為提取溶劑。

2.1.2凈化條件的選擇

本實驗分別選擇了快速量品前處理（quick， easy，cheap， effective， rugged， safe，QuEChERS）技術方法、SPE方法（C18柱和MAX混合陰離子交換柱），優化了不同洗脫溶劑的種類和用量，以基質效應定量表示凈化效果，比較了不同條件的凈化效率。結果表明，3 種方法的凈化效率從高到低依次是C18柱、MAX柱和QuEChERS方法。由于C18和乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）對水楊酸和赤霉酸有一定的吸附作用，導致QuEChERS方法的回收率較低，水楊酸和赤霉酸的回收率在40%～60%之間；而采用C18柱的SPE方法回收率最高，水楊酸和赤霉酸的回收率分別在87.6%～95.3%、83.8%～96.5%之間。綜合考慮凈化效率和成本（MAX柱成本較高），選取了C18柱作為番茄中水楊酸和赤霉酸的富集凈化柱，并篩選和優化了上量、活化、淋洗和洗脫溶劑，確定了最佳凈化程序。本實驗采用體積分數5%氨水堿化上量，甲醇和水活化，正己烷淋洗，3 mL體積分數5%乙酸-甲醇溶液能完全洗脫水楊酸和赤霉酸。

2.2質譜條件的優化

根據目標物的性質，采用負離子掃描模式，結果表明：水楊酸和赤霉酸進入一級質譜后，易產生穩定的［M-H］-分子離子峰。水楊酸的母離子為m/z 137.0，［M-H］-離子作為母離子進入二級質譜后發生斷裂產生不同的碎片離子，見圖1A。m/z 92.8特征碎片是由母體脫去—COOH生成，其響應值高且穩定，因此，將137.0＞92.8作為定量離子對。

赤霉酸的母離子為345.2，［M-H］-離子作為母離子進入二級質譜后發生斷裂或重排等反應產生不同的碎片離子，見圖1B。赤霉酸二級質譜的特征碎片m/z為142.9、220.9和239.2，其中m/z 142.9的響應值高且穩定，因此，將345.0＞142.9作為定量離子對。確定目標物的定量、定性離子對后，對其質譜參數進行優化，優化結果見1.3.3節。水楊酸和赤霉酸總離子流圖和提取離子流圖見圖2。

圖1 水楊酸（A）和赤霉酸（B）的二級質譜圖Fig.1 Product ion mass spectra of SA （A） and GA3（B）

圖2　赤霉酸和水楊酸總離子流圖和提取離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram and extract ion chromatogram of GA3（50 ng/mL） and SA （5 ng/mL）

2.3線性范圍與檢出限

以甲醇作為溶劑，分別配制不同含量梯度的2 種工作液，使水楊酸含量為1.25、2.5、5、10、20 μg/kg和赤霉酸的含量為10、20、50、100、200、1 000 μg/kg。將不同含量的標準溶液在上述選定的高效液相色譜-三重四極桿質譜條件下分別進行測定，通過液相色譜-質譜數據處理軟件繪制標準曲線和計算回歸方程及其相關系數。結果表明：2 種物質在以上含量范圍內，含量與其峰面積呈良好的線性關系，水楊酸線性回歸方程為y=1.27×105x+ 4.98×105，R2=0.998 4；赤霉酸線性回歸方程為y=4.34×103x+4.66×104，R2=0.993 3。取信噪比等于3所對應的待測物質量濃度作為檢出限，該方法水楊酸、赤霉酸的檢出限分別為0.01、0.15 ng/mL。

2.4回收率和精密度結果

為評價方法的準確性，分別測定了番茄中水楊酸和赤霉酸的加標回收率。選擇新采集的番茄作為基質量品，分別添加3 個水平（低、中、高）的上述2 種物質標準溶液，平行測定3 次，以基質加標為基準，計算平均回收率。表3顯示，水楊酸添加含量為1.25、2.50、5.00 μg/kg的回收率在87.6%～95.3%之間，相對標準偏差不大于6.9%；赤霉酸添加含量為10.0、50.0、100.0 μg/kg的回收率在83.8%～96.5%之間，相對標準偏差不大于6.7%。本方法準確、快速、靈敏度高，可用于番茄中植物內源激素的測定。

表3　番茄中水楊酸和赤霉酸的平均回收率及相對標準偏差Table 3 Average recoveries of different spiked levels and relative standard deviations （RSDs） for SA and GA3in tomato

2.5實際量品分析

表4　不同番茄樣品中水楊酸和赤霉酸的含量Table 4 Contents of SA and GA3in different tomato samples

為驗證該方法在實際量品中的檢測能力，采用上述方法對不同生長階段（0、3、7、14、21、28 d）的番茄量品進行了水楊酸和赤霉酸含量的測定，每個量品重復測定3 次，結果見表4。實驗表明，本方法的靈敏度、檢出限和精密度能夠滿足番茄中內源植物激素的測定。

3　結 論

本研究通過對量品前處理方法和色譜質譜條件的篩選和優化，建立了番茄量品中內源性植物激素——水楊酸和赤霉酸的高效液相色譜-三重四極桿質譜檢測方法，并應用于實際量品的分析。該方法分析時間短、檢出限低、線性范圍寬、回收率高，可適用于番茄等量品中水楊酸和赤霉酸的測定分析。

［1］ COLEBROOK E H， THOMAS S G， PHILLIPS A L， et al. The role of gibberellin signalling in plant responses to abiotic stress［J］. Journal of Experimental Biology， 2014， 217（1）: 67-75. DOI:10.1242/jeb.089938.

［2］ IQBAL N， UMAR S， KHAN N A， et al. A new perspective of phytohormones in salinity tolerance: regulation of proline metabolism［J］. Environmental and Experimental Botany， 2014， 100: 34-42. DOI:10.1016/j.envexpbot.2013.12.006.

［3］ TANK J G， PANDYA R V， THAKER V S. Phytohormones in regulation of the cell division and endoreduplication process in the plant cell cycle［J］. RSC Advances， 2014， 49（24）: 12605-12613. DOI:10.1039/C3RA45367G.

［4］ 許智宏， 李家洋. 中國植物激素研究: 過去、現在和未來［J］. 植物學通報， 2006， 23（5）: 433-442. DOI:10.3969/ j.issn.1674-3466.2006.05.001.

［5］ 符繼紅， 孫曉紅， 王吉德， 等. 植物激素定量分析方法研究進展［J］. 科學通報， 2010， 55（33）: 3163-3176. DOI:10.1007/s11434-010-4243-8.

［6］ LIU Bifeng， ZHONG Xuehua， LU Yingtang. Analysis of plant hormones in tobacco flowers by micellar electrokinetic capillary chromatography coupled with on-line large volume sample stacking［J］. Journal of Chromatography A， 2002， 945（1）: 257-265. DOI:10.1016/ S0021-9673（01）01503-5.

［7］ LIU Xin， MA Li， LIN Yawei， et al. Determination of abscisic acid by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection［J］. Journal of Chromatography A， 2003， 1021（1）: 209-213. DOI:10.1016/ j.chroma.2003.09.004.

［8］ 劉志勇， 沈春章， 董元彥. 氣相色譜法速測油菜中的乙烯釋放量［J］. 化學與生物工程， 2006， 23（2）: 55-56. DOI:10.3969/ j.issn.1672-5425.2006.02.020.

［9］ 周艷明， 忻雪. 高效液相色譜法測定果蔬中7 種植物激素的殘留量［J］.食品科學， 2010， 31（18）: 301-304.

［10］ DOBREV P I， HAVLí?EK L， VáGNER M， et al. Purification and determination of plant hormones auxin and abscisic acid using solid phase extraction and two-dimensional high performance liquid chromatography［J］. Journal of Chromatography A， 2005， 1075（1/2）: 159-166. DOI:10.1016/j.chroma.2005.02.091.

［11］ CLAUDIA B， ANIA K， JOACHIM K. Comprehensive chemical derivatization for gas chromatography-mass spectrometry-based multi-targeted profiling of the major phytohormones［J］. Journal of Chromatography A， 2003， 993（1）: 89-102. DOI:10.1016/S0021-9673（03）00356-X.

［12］ BARKAWI L S， TAM Y Y， TILLMAN J A， et al. A high-throughput method for the quantitative analysis of indole-3-acetic acid and other auxins from plant tissue［J］. Anal Biochemistry， 2008， 372（2）: 177-188. DOI:10.1016/j.ab.2007.08.009.

［13］ CATHERINE R， LARS G K， JOEL P A， et al. A rapid method for profiling of volatile and semi-volatile phytohormones using methyl chloroformate derivatisation and GC-MS［J］. Metabolomics， 2005，11（6）: 1922-1933. DOI:10. 1007/ s11306-015-0837-0.

［14］ DURGBANSHI A， ARBONA V， POZO O， et al. Simultaneous determination of multiple phytohormones in plant extracts by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2005， 53（22）: 8437-8442. DOI:10.1021/jf050884b.

［15］ PAN Xiangqing， WELTI R， WANG Xuemin. Simultaneous quantification of major phytohormones and related compounds in crude plant extracts by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry［J］. Phytochemistry， 2008， 69（8）: 1773-1781. DOI:10.1016/j.phytochem.2008.02.008.

［16］ 李艷， 徐繼林， 鄭立洋， 等. 高效液相色譜-三重四極桿質譜法同時測定羊棲菜5 個部位中10 種植物激素含量［J］. 色譜， 2014， 32（8）: 861-866. DOI:10.3724/SP.J.1123.2014.03049.

［17］ CUI Kunyuan， LIN Yaying， ZHOU Xi， et al. Comparison of sample pretreatment methods for the determination of multiple phytohormones in plant samples by liquid chromatography-electrospray ionizationtandem mass spectrometry［J］. Microchemical Journal， 2015， 121: 25-31. DOI:10.1016/j.microc.2015.02.004.

［18］ SCHMELZ E A， ENGELBERTH J， ALBORN H T， et al. Simultaneous analysis of phytohormones， phytotoxins， and volatile organic compounds in plants［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2003， 100（18）: 10552-10557. DOI:10.1073/ pnas.1633615100.

［19］ 白玉， 杜甫佑， 劉虎威. 植物激素檢測技術研究進展［J］. 生命科學，2010， 22（1）: 36-44. DOI:10.3969/j.issn.1672-352X.2003.02.027.

［20］ 陳菲， 陳麗璇， 劉鴻洲， 等. 質譜技術在植物內源激素檢測中的應用［J］. 亞熱帶植物科學， 2010， 39（4）: 69-73. DOI:10.3969/ j.issn.1009-7791.2010.04.018.

［21］ CAI Baodong， YE Ercui， YUAN Bifeng， et al. Sequential solvent induced phase transition extraction for profiling of endogenous phytohormones in plants by liquid chromatography-mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography B， 2015， 1004: 23-29. DOI:10.1016/j.jchromb.2015.09.031.

［22］ PAN Xiangqing， WELTI R， WANG Xuemin. Quantitative analysis of major plant hormones in crude plant extracts by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry［J］. Nature Protocols， 2010，5（6）: 986-992. DOI:10.1038/nprot.2010.37.

［23］ DELANEY T P， UKNES S， VERAOOIJ B， et al. A central role of salicylic acid in plant disease resistance［J］. Science， 1994， 266: 1247-1250.

［24］ 鮑峰偉， 楊運紅， 蘇國歲， 等. 高效液相色譜法測定煙草中的水楊酸［J］. 煙草科技， 2011（6）: 52-55. DOI:10.3969/ j.issn.1002-0861.2011.06.013.

［25］ 陳紅平， 劉新， 王川丕， 等. 分散固相萃取-超高壓液相色譜-串聯質譜法測定茶葉中赤霉酸和α-萘乙酸［J］. 分析化學， 2012， 40（7）: 1059-1064. DOI:10.3724/SP.J.1096.2012.11310.

［26］ 王偉華， 韓占江， 孟慶艷， 等. 基于HPLC-MS/MS的紅棗中氯吡脲與赤霉酸同時檢測方法的建立［J］. 中國食品學報， 2014， 14（3）: 219-224.

Simultaneous Determination of Salicylic Acid and Gibberellic Acid in Tomato by High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

LI Tengfei1， ZHAO Fengnian1， ZHANG Chao1， JIANG Zejun1， LIU Guangyang1， WANG Jing1，*， LIU Haijin2，XU Ping2， JIN Maojun1， JIN Fen1， SHAO Hua1， WANG Shanshan1， ZHENG Lufei1， SHE Yongxin1，*
（1. Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081，China； 2. Tibet Testing Center of Quality and Safety for Agricultural and Animal Husbandry Products， Lhasa 850000， China）

A sensitive and selective method was developed using high performance liquid chromatography-positive ion mode electrospray ionization-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS） for the simultaneous determination of salicylic acid（SA） and gibberellic acid （GA3） in tomato. The analytes were extracted with a mixture of acetic acid and acetonitrile； the extract was purified with solid-phase extraction （SPE） on an octadecylsilane （C18） column. Then SA and GA3in the extract were separated on a reversed phase C18column using a gradient elution program with 0.5% formic acid-methanol as the mobile phase. Qualitative analysis was performed with electrospray ionization in anion mode （ESI-） under multiple reaction monitoring （MRM） mode. The matrix-matched calibrations were used for quantitation. The calibration curves showed a good linearity in the concentration range of 1.25-20.00 and 10-1 000 ng/mL for SA and GA3， with correlation coefficients （R2）of 0.998 4 and 0.993 3， respectively. The average recoveries of SA and GA3in tomato were in the range of 87.6%-95.3% and 83.8%-96.5% at three spiked concentration levels， and relative standard deviations （RSD， n = 3） were less than 6.9%. The limits of quantitation （LOQ） for SA and GA3were 0.01， and 0.15 （ng/mL）， respectively. The method could be used for the rapid and accurate detection of these hormones in tomato.

salicylic acid； gibberellic acid； high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）； tomato

10.7506/spkx1002-6630-201608032

O657.6；S482.3

A

1002-6630（2016）08-0182-05

10.7506/spkx1002-6630-201608032. http://www.spkx.net.cn

2015-09-06

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD13B05-05）

李騰飛（1987—），男，博士研究生，研究方向為食品安全檢測。E-mail：litengfeibeyond@126.com

王靜（1963—），女，教授，博士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：w_jing2001@126.com佘永新（1972—），男，研究員，博士后，研究方向為食品安全檢測。E-mail：0891syx@163.com

引文格式：李騰飛， 趙風年， 張超， 等. 高效液相色譜-三重四極桿質譜法同時測定番茄中水楊酸和赤霉酸［J］. 食品科學， 2016，37（8）: 182-186.