PET瓶裝無氣天然礦泉水中污染菌及其系統進化分析

高 雯，胡曉敏，周幗萍，*

（1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.中國科學院武漢病毒研究所，湖北 武漢 430071）

PET瓶裝無氣天然礦泉水中污染菌及其系統進化分析

高 雯1，胡曉敏2，周幗萍1，*

（1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.中國科學院武漢病毒研究所，湖北 武漢 430071）

目的：了解某一批次聚對苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）瓶裝無氣天然礦泉水產生異味的緣由。方法：首先采用膜過濾結合平板菌落計數法分離和計數污染菌，16S rRNA序列分析鑒定其為假單胞菌屬（Pseudomonas spp.），再采用假單胞菌屬特異性rpoB引物進行梯度聚合酶鏈式反應優化擴增條件，產物進行測序和序列分析將污染菌鑒定到種。結果：這批產品的主要污染菌是一種2009年從南極分離鑒定的假單胞菌屬新種P. extremaustralis。反接實驗證實該菌能在天然礦泉水中生長繁殖，并產生刺激性異味。結論：P. extremaustralis部分細菌能夠透過兩級串聯0.2 μm過濾器，耐受中、低壓紫外殺菌工藝，耐低溫和低氧壓，能在無任何添加的PET瓶裝無氣天然礦泉水中生長并產生異味。

PET瓶裝無氣天然礦泉水；Pseudomonas extremaustralis；異味；紫外殺菌；兩級串聯0.2 μm過濾器

高雯， 胡曉敏， 周幗萍. PET瓶裝無氣天然礦泉水中污染菌及其系統進化分析［J］. 食品科學， 2016， 37（8）: 196-200.

GAO Wen， HU Xiaomin， ZHOU Guoping. Case analysis of contaminated bottled natural mineral water: isolation and phylogenetic analysis of contaminant bacteria［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 196-200. （in Chinese with English abstract）

2009年10月1日實施的GB 8537—2008《飲用天然礦泉水》中關于微生物指標增加了3 項，糞鏈球菌、銅綠假單胞菌和產氣莢膜梭菌，刪除了1 項菌落總數［1-2］。之前的《飲用天然礦泉水》國家標準要求灌裝產品菌落總數低于50 CFU/mL［2］。為達到這個標準，礦泉水企業普遍采用了臭氧殺菌工藝，但該工藝極易產生溴酸鹽，而國際癌癥研究中心認為溴酸鉀對實驗動物有致癌作用，但溴酸鹽對人的致癌作用還不能肯定，為此將其列為可能對人致癌的物質。因此，新國標和國際接軌，限定溴酸鹽含量不得超過0.01 mg/L，而不再限定菌落總數［3］。為響應新國標要求，一些新建生產線普遍采用紫外殺菌或無菌過濾工藝替代臭氧殺菌工藝，但是新工藝新設備的推廣過程中會遭遇新問題。天然礦泉水中存在著極微細胞ultramicrocells能透過0.2 μm或0.45 μm無菌細菌濾器。曾報道在水源地存在并具有極微細胞形態的有假單胞菌屬、黃桿菌屬（Flavobacterium）、弧菌屬（Vibrio）、螺菌屬（Spirillium）、沙雷氏菌屬（Serratia）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）。其中某些細菌，如假單胞菌、黃桿菌和鞘氨醇單胞菌，還是某些天然礦泉水源中地方性獨特種群之一。在低營養物環境或饑餓狀態，饑餓的細胞會形成球形或細長桿菌的極微細胞，它們不僅能透過無菌細菌過濾器還能在極低營養環境中繁殖。礦泉水企業必須認識到“無菌”細菌過濾器不能100%截留礦泉水中的細胞，更值得注意的是極微細胞生長緩慢，檢驗時容易被忽視或低估。目前沒有一種濾器能夠截留所有細胞，所以單純過濾除菌是不足以保證產品的長期穩定性［4］。

2015年1月，某企業生產的水源地為吉林長白山地區的某一批次聚對苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）無氣天然礦泉水遭消費者投訴產品有異味。企業召回產品后檢驗發現該批次有近1/3產品有刺激性異味，有人將其描述為類似臭雞蛋味，且細菌總數很高（不低于103CFU/250 mL）。為分析污染原因，本實驗室對變質產品和正常產品進行了比對分析。以期通過本次實驗確定污染菌種及其特性，為企業及時采取相應的控制和防治措施，也為行業提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

送檢的量品為2015年1月異常批次的5 瓶量品編號1～5和膜過濾后培養編號為24、27、28和34的平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）平板，以及12 瓶正常批次量品和膜過濾后培養的編號22的PCA平板。

某礦泉水生產企業生產的PET瓶裝天然礦泉水的主要工藝流程為：水源→50 μm過濾→50 μm過濾→超濾膜超濾→活性炭過濾→1 μm過濾→紫外殺菌→0.45 μm過濾→0.2 μm過濾→紫外殺菌→0.2 μm過濾→成品。

Premix Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）預混試劑、DL2000 DNA Marker、Goldview核酸染料 日本TaKaRa公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；PCA、伊紅美藍瓊脂（eosin-methylene blue medium，EMB）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA） 北京陸橋技術股份有限公司；Salmonella-Shigella（SS）瓊脂 英國Oxoid公司；Lysogeny broth （LB）培養基自制。PCR引物合成和產物測序均由蘇州金唯智科技有限公司完成。

1.2儀器與設備

無菌過濾器（配套0.2 μm濾膜） 德國密理博公司；T100 Thermal Cycler PCR儀 美國Bio-Rad公司；電子舌TS-5000Z（配有DBMS數據庫管理系統和APACHE2網絡服務器） 日本Insent公司；GeneGenius凝膠圖像分析系統 英國Syngene公司。

1.3方法

1.3.1量品中微生物的檢測、計數、染色觀察

采用0.2 μm膜過濾250 mL水量，然后取下濾膜分別貼在PCA/EMB/PDA 3 種平板上進行細菌總數/大腸桿菌/霉菌酵母總數計數；分離株在LB培養基上劃線分離單菌落用于提取DNA模板；純化后菌株在EMB和SS平板上劃線觀察菌落形態。莢膜染色參見文獻［5］的方法。

1.3.2菌裂解液的制備

LB平板劃線分離待測菌株，30 ℃培養24 h。挑取單菌落，加入裝有50 μL無菌去離子水的PCR管中，混勻，94 ℃ 10 min裂解，12 000 r/min離心5 min，收集上清液即菌裂解液，4 ℃保存。

1.3.3分離株的16S rRNA和rpoB序列分析

表1　PCR所用引物Table 1 Primers used for PCR

表2　PCR反應體系和條件Table 2 PCR systems and conditions

PCR引物、體系和條件參見表1、2，產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，Goldenview染色，凝膠成像分析儀觀察PCR擴增結果，產物送蘇州金維智公司測序。序列比對：在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進行比對。

1.3.4反接種驗證實驗

將污染菌反接種到正常無菌水量中，30 ℃培養30 d，做嗅覺和電子舌測試。

1.3.5電子舌測試

水量未做任何處理，直接倒入電子舌專用杯子后，靜止3 min，常溫檢測，采用了酸味、鮮味、咸味、澀味和苦味5 種傳感器，每個量品重復測定3 次。

1.3.6亞硝酸鹽含量測定

依據GB/T 8538—2008《飲用天然礦泉水檢驗方法》［8］。

1.3.7易揮發性成分分析

量品外送采取頂空氣相色譜法分析。

2　結果與分析

2.1量品檢測

正常量品平均亞硝酸含量為2 μg/L，而細菌總數異常的量品亞硝酸含量大幅上升，平均達90 μg/L，但尚未超過GB 8537—2008《飲用天然礦泉水》要求，亞硝酸鹽含量要低于0.1 mg/L［1］。頂空氣相色譜法分析結果顯示硫醚類化合物含量大幅升高。

肉眼觀察5 瓶異常批次量品與正常水量外觀無差異，未出現混濁、沉淀、變色等異常，其中4 瓶有難以描述的刺激性氣味。EMB培養基上有菌落出現，但并非典型的大腸菌群形態，所以大腸桿菌群值和霉菌酵母數未檢出，細菌總數和風味見表3。

表3　送檢樣品的細菌總數和風味Table 3 Total bacterial counts and flavor of samples

22號量品是異常批次之前的正常批次中偶然發現個別細菌總數偏高的計數平板，其分離株NMW22與異常批次的分離株明顯不同，在PCA平板上菌落形態為白色不透明小菌落，圓而邊緣整齊，老熟后微泛黃。顯微形態為革蘭氏陰性短桿菌，寬約0.2 μm，長0.2～1 μm。初始菌體均一，老熟后細胞內部出現著色不均一的特點（圖1A）。雖然不具備產莢膜細菌的光滑型菌落典型特征，但是莢膜染色結果類似NMW27，也是產莢膜菌。

從1、2、3、5號成品水量中分離的菌株和24、27、28、34號PCA平板中的分離株菌落形態和顯微形態很相似初步判斷為同類菌株。以NMW27為例，革蘭氏陰性短桿菌，寬約0.2～0.5 μm，長1.5～2 μm。PCA上菌落圓整、細小、扁平而半透明；SS培養基上近乎無色，邊緣圓整而透明，中心有乳頭量凸起，直徑僅為1 mm的細小菌落；EMB上為紫色直徑為2～3 mm小菌落，不濕潤不透明，邊緣不規整，表面發干，輕微發皺。菌落在PCA平板上有光滑型菌落的特征（表面光滑發黏），經莢膜染色證實為產莢膜菌（圖1B）。

圖1　2 個分離株的顯微照片Fig.1 Micrographs of two isolates

2.216S rRNA序列分析

圖2　MEGA 6.0用鄰近法基于16S rRNA基因序列構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree inferred by neighbor-joining method based on 16S rRNA gene sequences

如圖2所示，這次的污染菌是假單胞菌屬細菌（Pseudomonas spp.），與其相似度最高的主要有4 個種：P. veroni、P. extemaustralis、P. putida和P. flurescens。但是因為16S rRNA序列的高度保守性，一般認為16S rRNA序列分析只能準確鑒定到屬，不適合鑒定到種。而假單胞菌屬是一個龐大的類群，廣泛分布于環境中，包括土壤、水、植物和動物組織中。其中大部分是普通環境微生物，但也有條件致病菌如飲用天然礦泉水國標中嚴禁檢出的銅綠假單胞菌，還有食品中常見的腐敗菌熒光假單胞菌，為評估其安全性，需要對該污染菌準確鑒定到種。

2.3rpoB梯度PCR條件優化

圖3　假單胞菌屬rpoB引物的梯度PCR結果Fig.3 Gradient PCR analysis with rpoB primes for Pseudomonas

為準確鑒定到種，選用了rpoB序列作為靶序列，首先進行了梯度PCR以優化PCR條件。由圖3可知，假單胞菌屬的rpoB引物特異性很高，只有NMW27和NMW28兩株假單胞菌分離株出現了大小正確的產物，而Curbibacter屬的NMW22就沒有對應大小的擴增產物。此外，為獲得高質量的擴增產物進行測序，退火溫度應該取64 ℃。

2.4rpoB序列分析

圖4　MEGA 6.0用鄰近法基于rpoB基因序列構建的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree inferred by neighbor-joining method based on rpoB gene sequences

研究表明目前假單胞菌屬中至少有202 個種［9］，它們大體可以分為P. fluorescens、P. yringae、P. anguilliseptica、P. putida、P. straminea、P. oleovorans、P. aeruginosa和P. stutzeri 8 大群［10］。由圖4可知，分離株NMW3、 NMW27是P. extremaustralis種的細菌，在進化樹上與條件致病菌銅綠假單胞群（P. aeruginosa）距離比較遠，而與常見的耐低溫食品腐敗菌-熒光假單胞菌屬于同一個群P. fluorescens group。

2.5反接驗證實驗結果

圖5　接種驗證實驗的味覺雷達圖Fig.5 Radar chart of taste analysis for inoculation test

將污染菌分離株NMW27反接到3 瓶正常水量中，空白實驗證實該批次水量的細菌總數未檢出，30 ℃放置30 d，選5 個人做嗅覺評價，有4 人覺得反接的3 個量有難描述的刺激性異味，1 人未覺得有任何異常，做平板菌落計數發現細菌總數不小于103CFU/mL。取這3 瓶反接量品做電子舌檢測，觀察污染菌對水量味覺的影響。從圖5可知，污染菌給水量帶來的很細微的味覺變化，總體來說水中澀味、苦回味和澀回味都有所上升。

3　討 論

正常批次檢出污染菌NMW22為Curbibacter屬，該屬為革蘭氏陰性類弧菌或微彎曲的桿菌，（0.3～0.9） μm×（1.1～1.8） μm，是2004年新建的屬［11］。目前有4 個種C. gracilis、C. lanceolatu、C. delicatus和C. fontanus。C. lanceolatu是從Pseudomonas lanceolatu Leifson 1962變更而來，其模式株最初就分離自日本和溫哥華的蒸餾水。C. gracilis和C. delicatus的模式株都從井水中分離［11］。而C. fontana模式株也是從井水中分離的微需氧菌［12］。Silbaq［13］采用免培養的FISH技術證實β變形菌亞綱目伯克霍爾德目細菌是無氣天然礦泉水中能活躍繁殖的優勢細菌種群。而Curbibacter屬正是隸屬于伯克霍爾德目。由此可推測該屬細菌是水（水源地）中細菌種群之一。NMW22可以推測污染源是水源地，而且該菌也能在天然礦泉水中生長，但未造成嗅覺或味覺的異常。

P. extremaustralis是2009年第1次報道的從南極短暫形成的湖泊中64°09’S、60°57’W分離出的一種非致病性新菌種，能產熒光色素，4～37 ℃生長，42 ℃不生長。菌落光滑、圓整、無色。以辛酸鈉為碳源時細胞內會積累聚三羥基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）［14-15］。其抗逆能力和環境適應性強，目前研究已發現其能降解多種復雜化合物，厭氧生長、耐氧化和滲透壓壓力，耐低溫、耐熱等獨特能力，而且這些抗逆性推測與PHB的積累和生物膜形成能力有關聯［16-19］。我國蘭州大學團隊也曾從烏魯木齊河源區高寒冰緣植物中分離到一株內生適冷菌假單胞菌P. extremaustralis PF［20］。

從本次污染案例來看，該批次產品1月出廠檢測時細菌總數幾乎未檢出，可是1～2個月召回后發現近1/3產品細菌總數超標，甚至達到103～105CFU/mL；另外2/3產品細菌總數正常基本未檢出，可以推測該批次產品出廠時只偶然有微量污染菌存在，但是該污染菌能在1～2 個月內快速增殖104以上，推測：經檢測礦泉水瓶子密封性完好，僅有少量頂空空氣存在，可推測污染菌能厭氧或在極低氧壓的環境中生長繁殖；兩級串聯0.2 μm無菌過濾器的濾膜完整性測試結果正常，推測有少數極微細胞可以透過兩級串聯0.2 μm無菌過濾器；生產線紫外殺菌設備各項參數和運行記錄正常，推測該菌可能具有耐紫外能力；產品無任何添加，且經過8道過濾，其有機營養物含量極其低微，推測污染菌營養要求非常簡單；企業位于長白山地區，1月批次中出現該菌株污染，而且能在我國北方地區1～2 個月內就能大幅增殖并導致產品變質，推測污染菌能耐低溫。

該批次與之前和之后批次的不同是啟用了活性炭過濾器，啟用之前用RO水反復沖洗活性炭濾器長達36 h以達到活性炭濾器運行的pH值的要求，而事后活性炭濾器出口水量確實出現大量類似P. extremaustralis的菌落，說明該細菌可能在活性炭濾器中富集增殖，給后續濾器和紫外殺菌機增加工作負荷。之前的研究［21-25］也多次證實活性炭多孔材料容易吸附多種微生物，有的甚至能在活性炭中繁殖。之所以該批次出現嚴重污染即可能是活性炭過濾器使用不當，導致該細菌有機會在活性炭過濾器中吸附、大量富集和繁殖所致。

該企業污染的P. extremaustralis具有很強的抗逆性，有莢膜，具備生物膜形成能力，耐低溫、耐紫外殺菌，耐低氧壓，具有極微細胞能透過“無菌”過濾器，營養要求簡單，在瓶裝天然礦泉水中能生長，代謝產生亞硝酸鹽和硫醚類異味物質，產生輕微澀味、苦回味和澀回味，對礦泉水企業危害很大。隨著我國礦泉水工業的發展，新技術和新工藝采用和改良，食品安全性得到重視和提高，但是也必須注意某些特殊微生物可能突破多種除菌屏障導致產品質量問題，甚至是安全問題。

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Case Analysis of Contaminated Bottled Natural Mineral Water: Isolation and Phylogenetic Analysis of Contaminant Bacteria

GAO Wen1， HU Xiaomin2， ZHOU Guoping1，*
（1. School of Biology and Pharmaceutical Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China；2. Wuhan Institute of Virology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430071， China）

Objective: To figure out the cause of the occurrence of unpleasant odor in one batch of polyethylene terephthalate（PET） bottled natural mineral water. Methods: Firstly， we counted and isolated strains from the samples by membrane filtration and culture on plate count agar （PCA）. Secondly， the main spoilage bacteria were identified as Pseudomonas spp. by 16S rRNA analysis. Then gradient PCR was used to optimize the PCR conditions for amplification of rpoB gene. The PCR amplified rpoB sequence was analyzed. Results: The main pollutant bacteria in this batch of bottled drinking water was found to belong to a new species of P. extremaustralis， which was firstly isolated from a temporary pond in Antarctica in 2009. The rpoB sequence analysis showed that P. extremaustralis spp. was responsible for the occurrence of off-flavor in natural mineral water. When being inoculated back into normal products， it grew well and stink. Conclusion: Some strains of P. extremaustralis spp. have the capability of passing through double 0.2 μm-pore-size filters， tolerating ultraviolet sterilization， growing in PET bottled natural mineral water at low temperature and low oxygen content， and giving out an unpleasant odor.

PET bottled natural mineral water； Pseudomonas extremaustralis； odor； ultraviolet sterilization； two-step tandem filtration through 0.2 μm-pore-size filters

10.7506/spkx1002-6630-201608035

Q939.97

A

1002-6630（2016）08-0196-05

10.7506/spkx1002-6630-201608035. http://www.spkx.net.cn

10.7506/spkx1002-6630-201608035. http://www.spkx.net.cn

2015-07-17

中國科學院農業與環境微生物學重點實驗室開放研究項目（2015AEM001）

高雯（1990—），女，碩士研究生，研究方向為微生物。E-mail：954215297@qq.com

周幗萍（1971—），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物安全。E-mail：wjczgp@163.com

引文格式：