直接競爭化學發光酶免疫法檢測呋喃妥因代謝物

李亞楠，王 瑞，李 濤，王云貴，黃登宇，*

（1.山西大學生命科學學院，食品藥品快速檢測中心，山西 太原 030006；2.山西先鋒科技開發有限公司，山西 太原 030006；3.深圳易瑞生物技術有限公司，廣東 深圳 518101）

直接競爭化學發光酶免疫法檢測呋喃妥因代謝物

李亞楠1，王 瑞1，李 濤2，王云貴3，黃登宇1，*

（1.山西大學生命科學學院，食品藥品快速檢測中心，山西 太原 030006；2.山西先鋒科技開發有限公司，山西 太原 030006；3.深圳易瑞生物技術有限公司，廣東 深圳 518101）

建立檢測動物組織中呋喃妥因代謝物的直接競爭化學發光酶免疫法。采用棋盤法確定抗體和酶標抗原的最佳稀釋度，通過單因素試驗優化包被條件、封閉液種類和競爭反應時間，建立直接競爭抑制曲線，并對方法的靈敏度、特異性、準確度和精密度進行方法學評價。結果表明，經優化，最佳反應條件為抗體稀釋度1∶4 000，酶標抗原稀釋度1∶80，包被條件為37 ℃ 2 h后4 ℃過夜，封閉液為1%牛血清白蛋白，競爭反應1 h。該方法的線性檢測范圍為0.030～10.595 ng/mL，IC50為0.559 ng/mL；加標回收率為84.9%～103.4%，批內變異系數為3.4%～7.8%，批間變異系數為4.7%～11.8%；除與呋喃妥因原藥交叉反應率為36.2%，與其他結構類似物及衍生化試劑交叉反應率均小于0.1%。該方法靈敏、準確，可用于動物組織中呋喃妥因代謝物的快速篩查。

呋喃妥因；1-氨基-乙內酰脲；直接競爭化學發光酶免疫檢測；動物組織

李亞楠， 王瑞， 李濤， 等. 直接競爭化學發光酶免疫法檢測呋喃妥因代謝物［J］. 食品科學， 2016， 37（8）: 231-235.

LI Yanan， WANG Rui， LI Tao， et al. Detection of furantoin metabolite by direct competitive chemiluminescene enzyme immunoassay［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 231-235. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608042. http://www.spkx.net.cn

硝基呋喃類獸藥是一類人工合成的廣譜抗菌藥，用于預防和治療由大腸桿菌和沙門氏菌引起的胃腸道感染，主要包括呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮和呋喃西林［1-2］。這類藥物進入動物體后，很快代謝為相應的代謝物1-氨基-乙內酰脲（1-amino-hydantoin，AHD）、3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-5-morpolinomethyl-2-oxazolidone，AMOZ）和氨基脲（semicarbazide，SEM）［3］，并在動物體內長期穩定存在［4］。由于硝基呋喃類藥物及其代謝物對人體有潛在致癌、致突變作用，很多國家禁止用于食品生產的動物使用此類藥物［5］。但是此類抗生素成本低、預防和治療細菌感染效果明顯，因此仍然被非法使用［6-7］。

目前，檢測動物源食品中AHD的方法有高效液相色譜法［8］、液相色譜-串聯質譜法［9-11］、膠體金免疫層析法［12-13］和酶聯免疫吸附法［2，14-15］。儀器分析法雖然準確度和精確度高、重復性好，且可同時檢測多種物質，但是檢測時間長、成本高、操作技術要求高［16］；膠體金免疫層析法操作簡便、快速，但是只可對待測物進行半定量檢測，且準確度低；酶聯免疫吸附法具有較高的準確度和精確度、較強的特異性，技術要求不高，可實現大批量檢測。化學發光酶免疫（chemiluminescene enzyme immunoassay，CLEIA）法將化學發光反應與免疫反應相結合，通過過氧化物酶與化學發光底物作用，檢測化學發光信號，進而對待測物進行定量檢測；具有酶聯免疫吸附法操作簡便、快速等特點，但是靈敏度更高［17］，現已廣泛用于食品分析檢測中［18-20］。

本實驗制備得到了AHD酶標抗原，優化主要反應條件，建立了檢測AHD的dc-CLEIA方法，可用于食品中AHD殘留的快速篩查，為研制AHD快速檢測試劑盒提供技術支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豬里脊肉、雞胸肉、鯉魚肉 市購。

AHD單克隆抗體 北京艾旗斯德科技有限公司；AHD、1-（2-硝基苯亞甲基）-氨基乙內酰脲（1-［（2-nitrobenzylidene）-amino］-imidazolidin-2，4-dione，NPAHD）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、魯米諾 美國Sigma公司；半抗原1-（4-羧基苯亞甲基）-氨基乙內酰脲（1-［（4-carbo-benzylidene）-amino］-imidazolidin-2，4-dione，CPAHD） 本實驗室自制；其他化學試劑均為國產分析純。

將魯米諾、過氧化氫脲和對碘苯酚按照物質的量比為5∶3∶7配制化學發光液［21］。

1.2儀器與設備

96 孔化學發光板 美國Thermo公司；INFINITE 200PRO酶標儀 瑞士Tecan公司；UV-1600PC紫外-可見分光光度計 上海美普達儀器公司。

1.3方法

1.3.1制備酶標抗原（CPAHD-HRP）

采用活性酯法制備酶標抗原［22］，具體操作如下：稱取2.5 mg CPAHD溶于100 μL 2，2-二甲氧基丙烷中，加入1.8 mg N-羥基丁二酰亞胺和3.4 mg N，N'-二環己基碳二亞胺，混勻，室溫條件下避光攪拌反應15 h，得A液；稱取2.6 mg HRP溶于1.0 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS，pH 7.4，0.01 mol/L）中，得B液；將A液逐滴加入B液中，室溫條件下攪拌反應3 h。將反應后混合液移至透析袋中，PBS透析3 d后，4 500 r/min離心5 min，取上清液，即為偶聯物CPAHD-HRP，用紫外-可見分光光度計進行掃描。

1.3.2AHD直接競爭CLEIA法操作步驟

用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6，0.05 mol/L）將AHD單克隆抗體稀釋后，每孔100 μL加入到96 孔化學發光板中進行包被；甩干孔內液體，用PBST溶液（含0.05% Tween-20，pH 7.4，0.01 mol/L的PBS）洗板3 次，在吸水紙上拍干，每孔加入200 μL封閉液，37 ℃封閉2 h，洗板拍干；每孔加入50 μL NPAHD溶液或量品溶液和50 μL酶標抗原，37 ℃反應，洗板拍干；每孔加入100 μL化學發光液，室溫避光反應4 min，用酶標儀測各孔化學發光強度（relative light unit，RLU）。

1.3.3直接競爭CLEIA法條件優化

采用棋盤法確定抗體和酶標抗原的最佳工作濃度，設置抗體稀釋度為1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000，1∶8 000、1∶16 000，酶標抗原稀釋度為1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320，按照1.3.2節的步驟測定RLU值，同時做陰性對照（不加NPAHD溶液），每個實驗3 次重復，計算平均值。根據B/B0（B為加NPAHD時RLU值，B0為不加NPAHD時RLU值）值確定最佳組合。

通過單因素試驗確定最佳包被條件、封閉液種類和競爭時間。分別設置3 組包被條件：4 ℃包被過夜（1組）、37 ℃包被2 h后4 ℃包被過夜（2組）和37 ℃包被2 h（3 組）；3 種不同封閉液：1%脫脂乳粉（1組）、1%明膠（2組）和1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（3組）；4 個競爭時間：40、60、120、150 min，按照1.3.2節的步驟測定化學發光強度RLU值，每個條件3 次重復。繪制各條件下標準曲線，計算IC50（IC50為B/B0為0.5時相應的NPAHD質量濃度）和RLUmax/IC50（RLUmax為最大化學發光值）。以IC50和RLUmax/IC50作為確定最佳條件的依據，IC50越小，RLUmax/ IC50越大，靈敏度越高［19］。

1.3.4量品前處理

取1.0 g量品，加入4 mL超純水均質；加入0.5 mL HCl溶液（1.00 mol/L）和100 μL鄰硝基苯甲醛（0.01 mol/L），混勻，37 ℃振蕩反應16 h；加入5 mL K2HPO4溶液（0.1 mol/L）、0.4 mL NaOH溶液（1mol/L）和5 mL乙酸乙酯，室溫振蕩1 min；4 500 r/min離心10 min，取上清液至潔凈容器中，氮氣吹干；加入1.5 mL正己烷重新溶解，再加入0.5 mL PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）混勻；4 500 r/min離心10 min，取下層水相用于CLEIA測定［23］。

1.3.5方法學評價

1.3.5.1建立直接競爭CLEIA法標準曲線

配制質量濃度為100、20、4、0.8、0.16、0.032 ng/mL的NPAHD溶液，按照1.3.2節的步驟及上述優化后最佳反應條件進行操作，測定RLU值，每個質量濃度3 次重復。以NPAHD溶液質量濃度常用對數值為橫坐標，B/B0值為縱坐標，繪制標準曲線，得出線性方程，計算靈敏度IC50和線性范圍（IC20～IC80）。

1.3.5.2直接競爭CLEIA法特異性測定

直接競爭CLEIA法的特異性用交叉反應率（cross reactivity，CR）衡量，NPAHD結構類似物的CR越小，該方法的特異性越好。

將NPAHD結構類似物呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、AHD、AOZ、AMOZ、SEM及其相應代謝物衍生物3-（2-硝基苯亞甲基）-氨基-2-惡唑烷酮（3-［（2-nitro-benzylidene）-amino］-2-oxazolidone，NPAOZ）、5-（4-嗎啉基）-3-（2-硝基苯亞甲基）-氨基-2-惡唑烷酮（5-（4-morpholinymethyl）-3-｛［（2-nitrophenyl）methylene］amino｝-2-oxazolidinone，NPAMOZ）、2-硝基苯亞甲基-氨基脲（2-nitrobenzaldehyde-semicarbazone，NPSEM）和衍生化試劑對醛基苯甲酸（carboxybenzaldehyde，4-CBA）、鄰硝基苯甲醛分別配制成100、20、4、0.8、0.16、0.032 ng/mL系列質量濃度，按照1.3.2節的步驟進行測定，按下式計算CR。

1.3.5.3直接競爭CLEIA法準確性和精密度測定

準確性表示檢測值與真實值的符合程度，可用加標回收率衡量；精密度表示該檢測方法的重復性，可用批內變異系數和批間變異系數衡量。通過對準確性和精密度的測定，可以驗證該方法的可靠性。

對空白豬肉、雞肉和魚肉進行加標回收實驗，分別添加1、5 ng/g和10 ng/g三個水平的AHD標準品。每個水平做5 次重復，并分批進行5 次實驗。按照1.3.4節的步驟對量品進行前處理后用所建立的CLEIA法測定，計算回收率、批內變異系數和批間變異系數。

1.3.5.42 種CLEIA法量品檢測限的比較

取空白豬肉20 份，按照1.3.4節的步驟進行處理后分別采用建立的直接競爭CLEIA法與間接競爭CLEIA法進行測定（在前期研究中，本實驗室已建立了AHD檢測的間接競爭CLEIA法，見文獻［21］），依據各自線性方程計算對應量品的NPAHD質量濃度。量品最低檢測限為對應量品NPAHD質量濃度平均值加3 倍標準差。

2　結果與分析

2.1酶標抗原CPAHD-HRP的紫外鑒定

圖1　CPAHD、HRP和CPAHD-HRP紫外掃描圖譜Fig.1 UV spectra of CPAHD， HRP and CPAHD-HRP

由圖1可見，CPAHD的特征吸收峰在298 nm波長處，HRP的特征吸收峰在403 nm波長處；CPAHD-HRP分別在297 nm和401 nm波長處有兩處吸收峰，同時具有CPAHD和HRP的特征，且與CPAHD和HRP相比，吸收峰發生了偏移，說明CPAHD-HRP偶聯成功。

2.2最佳反應條件的確定

2.2.1抗體與酶標抗原稀釋度的確定

表1　不同抗體和酶標抗原稀釋度條件下的B/B0值Table 1 B/B0values of different dilutions of antibody and enzyme-labeled antigen

由表1可見，抗體稀釋度為1∶2 000，酶標抗原稀釋度為1∶160時，B/B0值最小，為0.162 4；抗體稀釋度為1∶4 000，酶標抗原稀釋度為1∶80時，B/B0值為0.163 9。競爭化學發光酶免疫反應中，B/B0越小，靈敏度越高；適當加大抗體或酶標抗原稀釋度，可提高靈敏度。結合考慮抗體與酶標抗原的成本，選擇抗體稀釋度為1∶4 000，酶標抗原稀釋度為1∶80。

2.2.2包被條件的確定

由圖2可見，3 種包被條件下，IC50逐步增大，RLUmax/IC50先增大后減小。第2組（37 ℃包被2 h后4 ℃包被過夜）的RLUmax/IC50最大，表明先37 ℃包被，有助于抗體在化學發光板上快速吸附，再4 ℃孵育過夜，可使抗體包被均勻，靈敏度提高。因此選擇37 ℃包被2 h后4 ℃包被過夜為最佳包被條件。

圖2　AHD CLEIA法包被條件優化Fig.2 Optimization of coating conditions for dc-CLEIA of AHD

2.2.3封閉液的確定

圖3　AHD dc-CLEIA法封閉液優化Fig.3 Optimization of blocking liquid for dc-CLEIA of AHD

由圖3可見，明膠封閉時的IC50最高，1%脫脂乳粉和1% BSA封閉時的IC50接近；1% BSA封閉時的RLUmax/IC50最大，1%明膠和1%脫脂乳粉封閉時的RLUmax/IC50相差不大。因此綜合考慮IC50和RLUmax/IC50，選擇BSA為最佳封閉液。

2.2.4競爭時間的確定

圖4　AHD dc-CLEIA法競爭時間優化Fig.4 Optimization of competitive reaction time for dc-CLEIA of AHD

如圖4所示，隨著競爭反應時間的延長，IC50先減小后增大，1 h時最小；RLUmax/IC50先增大后趨于穩定，1 h時最大。因此選擇1 h為最佳競爭時間。

2.3方法學評價

2.3.1標準曲線的建立

最佳反應條件下建立的標準曲線方程為y=-0.234 9x+ 0.440 8，IC50為0.559 ng/mL，在0.030～10.595 ng/mL范圍內，呈線性關系，可進行精確檢測。

2.3.2特異性實驗結果

表2　AHD-CLEIA法特異性測定結果Table 2 Specificity of AHD-CLEIA

由表2可知，AHD直接競爭CLEIA法對呋喃妥因原藥的CR為36.2%，與其他結構類似物及衍生化試劑的CR均小于0.1%。但是呋喃妥因原藥在動物體內分解代謝快，在實際量品檢測中不存在呋喃妥因原藥與抗體競爭性結合。表明該方法所用AHD單克隆抗體特異性好。

2.3.3準確性和精密度實驗結果

表3　AHD-CLEIA法的準確性和精密度實驗結果Table 3 Accuracy and precision of AHD-CLEIA

對空白豬肉、雞肉和魚肉量品進行3 個水平的加標回收實驗，測定結果見表3，加標回收率在84.9%～103.4%之間，相應的批內變異系數在3.4%～7.8%之間，批間變異系數在4.7%～11.8%之間。表明該方法的準確度高、重復性好。

2.3.42 種CLEIA法量品檢測限的比較

2 種CLEIA法對豬肉量品的最低檢測限測定結果見表4。本研究建立的直接競爭CLEIA法在豬肉量品中的檢測限低于間接競爭CLEIA法，且操作更為簡便、檢測時間更短。

表4　2 種CLEIA法樣品檢測限的比較Table 4 Comparison of limit of detection between the two CLEIA methods μg/kg

3　結 論

本實驗建立了檢測動物組織中AHD殘留的直接競爭化學發光法，IC50為0.559 ng/mL，低于Jiang Wenxiao等［2］建立的酶聯免疫法的0.68 ng/mL，表明其靈敏度較高；在0.030～10.595 ng/mL范圍內可進行精確檢測。對豬肉、雞肉、魚肉在1、5、10 ng/g三個添加水平的回收率在84.9%～103.4%之間，批內變異系數低于10%，批間變異系數低于12%。豬肉量品檢測限為0.015 μg/kg，低于國家標準中液相色譜-串聯質譜法的0.5 μg/kg［24］。本實驗建立的AHD直接競爭CLEIA法與王瑞等［21］建立的AHD間接競爭CLEIA法相比，靈敏度較高，量品檢測限較低，且省去了加入酶標二抗反應這一步，檢測時間更短。因此，本研究建立的直接競爭CLEIA法靈敏度、準確度和精確度高，且操作簡便、快速，可用于食品中AHD殘留的大量篩查。但是由于該方法標準曲線中B/B0值偏低，在實際檢測中可能導致測定結果偏低。

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Detection of Furantoin Metabolite by Direct Competitive Chemiluminescene Enzyme Immunoassay

LI Yanan1， WANG Rui1， LI Tao2， WANG Yungui3， HUANG Dengyu1，*
（1. Food and Drug Rapid Inspection Center， College of Life Science， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；2. Shanxi Vanguard Technology Co. Ltd.， Taiyuan 030006， China；3. Shenzhen Bioeasy Biotechnologies Co. Ltd.， Shenzhen 518101， China）

A direct competitive chemiluminescene enzyme immunoassay （dc-CLEIA） was developed to detect furantoin metabolite in animal tissues. The optimal dilutions of monoclonal antibody and enzyme labeled antigen were determined by chequerboard titration. The effects of coating conditions， blocking solution and competitive reaction time were investigated by single-factor experiments. The optimized reaction conditions were determined as follows: 4 000-fold dilution of monoclonal antibody 80-fold dilution of enzyme labeled antigen， 2 h incubation at 37 ℃ for coating followed by overnight storage at 4 ℃， blocking with 1% BSA， and 1 h competitive reaction. The linear detection range of the developed CLEIA was 0.030-10.595 ng/mL， and the 50% inhibitory concentration （IC50） value was 0.559 ng/mL. The recoveries in negative samples ranged from 84.9% to 103.4%. The intra-assay and inter-assay coefficients of variation were 3.4%-7.8% and 4.7%-11.8%， respectively. The cross-reactivity values were lower than 0.1% with other structural analogues and derivatives expect for furantoin original drug （36.2%）. The CLEIA method was sensitive and accurate， and thus suitable for the fast screening of furantoin metabolite in food samples.

furantoin； 1-amino-hydantoin （AHD）； direct competitive chemiluminescent enzyme immunoassay； animal tissues

10.7506/spkx1002-6630-201608042

TS207.3

A

1002-6630（2016）08-0231-05

10.7506/spkx1002-6630-201608042. http://www.spkx.net.cn

2015-07-20

李亞楠（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品新工藝與食品安全。E-mail：nan4050@163.com

黃登宇（1968—），男，副教授，博士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：Huangdy1110@126.com

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