基于寬譜特異性抗體的β2-激動劑多殘留電化學免疫傳感器的研制

任鵬飛，邵科峰，張 潔，張紅琳，趙 波，*

（1.江蘇省生物醫藥功能材料協同創新中心，江蘇省生物功能材料重點實驗室，南京師范大學化學與材料科學學院，江蘇 南京 210023；2.南京曉莊學院食品科學學院，江蘇 南京 211171）

基于寬譜特異性抗體的β2-激動劑多殘留電化學免疫傳感器的研制

任鵬飛1，邵科峰1，張 潔1，張紅琳2，趙 波1，*

（1.江蘇省生物醫藥功能材料協同創新中心，江蘇省生物功能材料重點實驗室，南京師范大學化學與材料科學學院，江蘇 南京 210023；2.南京曉莊學院食品科學學院，江蘇 南京 211171）

制備了沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清蛋白偶聯物，并通過動物免疫獲得了抗沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清蛋白寬譜特異性抗體，同時制備了石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇修飾的電化學免疫傳感器，并采用循環伏安法和交流阻抗法對電極的電化學性質進行研究。采用間接競爭法進行了克倫特羅、沙丁胺醇和特布他林3 種β2-激動劑的同時檢測，檢出限依次為0.2、0.3 ng/mL和0.3 ng/mL，線性范圍依次為50～7 000、1～1 500 ng/mL和100～6 000 ng/mL。將傳感器應用于豬瘦肉、豬脂肪和豬肝3 種實際量品中克倫特羅的加標檢測，回收率為84.7%～106%。實現了β2-激動劑的高靈敏多殘留免疫檢測。

寬譜特異性抗體；β2-激動劑；多殘留；電化學免疫傳感器

任鵬飛， 邵科峰， 張潔， 等. 基于寬譜特異性抗體的β2-激動劑多殘留電化學免疫傳感器的研制［J］. 食品科學， 2016，37（8）: 236-241. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608043. http://www.spkx.net.cn

REN Pengfei， SHAO Kefeng， ZHANG Jie， et al. Development of a multi-residue electrochemical immunoassay based on broad-spectrum specific antibody for determination of β2-agonists［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 236-241. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608043. http://www.spkx.net.cn

β2-激動劑類獸藥（俗稱“瘦肉精”）是目前動物源性食品中檢出率最高、危害最嚴重的化學性殘留危害物之一。β2-激動劑曾作為動物飼料的添加劑使用，旨在降低動物脂肪含量、提高蛋白質含量。然而，當人食用含有β2-激動劑的肉類后，會出現心悸、肌肉顫動、頭暈、乏力等異常情況。長期食用會增加染色體畸變的可能性并誘發惡性腫瘤［1-2］，因此我國和世界上大多數國家都規定在動物性食品中不得檢出，這就對分析方法的檢測靈敏度提出了非常高的要求。目前常用的檢測方法可分為色譜分析法［3-6］、電化學法［7-9］、免疫分析法［10-12］等。現有檢測技術由于儀器具有局限性而不適合作為高通量快速篩選方法，因此能夠高通量、高靈敏檢測多種β2-激動劑的分析方法成為當前該領域的急需。

電化學傳感器是一種快速、便捷且成本低廉的檢測技術；免疫分析法具有準確性好、靈敏度高和量品前處理簡單等優點。電化學免疫傳感器［13-17］結合了電化學傳感器和免疫分析法的優點，是目前較為先進的一種檢測方法。石墨烯具有優異的導電性能［18］，在電化學傳感器的研制中得到大量應用［19-20］；殼聚糖含有大量羥基和氨基且具有良好的成膜性和生物相容性，常被用于固定生物大分子［21］；本實驗將石墨烯優良的電化學性質、殼聚糖良好的成膜性能以及寬譜特異性抗體相結合，研制出一種β2-激動劑多殘留電化學免疫傳感器，進行了3 種激動劑（克倫特羅、沙丁胺醇和特布他林）的同時檢測，并對實際量品進行了加標檢測。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

豬肉實際量品購自南京市超市。

克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林（純度＞99%） 中國食品藥品檢定研究院；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京元亨圣馬生物技術研究所；抗沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清蛋白偶聯物（salbutamol-ractopamine-bovine serum albumin conjugate，SAL-RAC-BSA）抗體 南京曉莊學院生物化工與環境工程學院；磷酸緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）由0.1 mol/L的磷酸氫二鈉和0.1 mol/L的磷酸二氫鈉按一定比例配得；提取液由乙腈和丙酮（均為分析純）按1∶1的體積比配制；其他試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

FA-1004電子分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；KQ-50E超聲波清洗器 昆山超聲波儀器有限公司；PHS-3E pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；CHI 852C和660E電化學分析儀（配三電極體系：工作電極為玻碳電極，對電極為鉑電極，參比電極為Ag/AgCl電極） 上海辰華儀器有限公司；UV-1700PC紫外-可見分光光度計 上海鳳凰光學科儀有限公司；H7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；JSM-7600F高分辨熱場發射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社。

1.2方法

1.2.1石墨烯-殼聚糖分散液制備

采用改良的Hummers法［22-23］制備石墨烯；將石墨烯分散于殼聚糖溶液制得分散均勻的石墨烯-殼聚糖分散液［23］。

1.2.2石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇修飾的多殘留免疫傳感器的制備

電極拋光及處理：依次使用直徑為1.0、0.3 μm和0.05 μm的γ-氧化鋁粉將玻碳電極拋光至表面呈現鏡面光澤，用大量水沖洗，然后依次用無水乙醇：二次蒸餾水（1∶1，V/V）、二次蒸餾水清洗，室溫晾干。

取上述玻碳電極，在其表面滴涂4 μL制備好的石墨烯-殼聚糖分散液，再滴涂2 μL 0.2 g/L的沙丁胺醇標準溶液，在37 ℃烘箱中干燥30 min，使石墨烯-殼聚糖和沙丁胺醇完全固定于電極表面；然后將電極置于質量分數為0.05%的BSA溶液中浸泡30 min，以封閉石墨烯-殼聚糖表面未被沙丁胺醇結合的活性位點，從而減少非特異性吸附；封閉完成后用pH 7.4的PBS沖洗電極，制得石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇修飾的電化學免疫傳感器。

1.2.3免疫傳感器的表征

采用紫外-可見吸收光譜法、循環伏安法和交流阻抗法對裸電極以及電極在修飾過程中的電化學性質變化進行了研究。紫外-可見吸收光譜的測定過程為：取干凈的石英玻片，模量在電極表面的修飾過程，在其表面滴涂600 μL的石墨烯-殼聚糖分散液，再滴涂300 μL 0.2 g/L的沙丁胺醇標準溶液（石墨烯-殼聚糖和標準溶液量的比例與電極修飾相同）。37 ℃烘箱中晾干，用干凈的刀片刮下置于蒸餾水中分散均勻后測得其吸收光譜。

所有電化學實驗均采用三電極系統（玻碳電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極）在含有2 mmol/L K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］和0.1 mol/L KCl的PBS（pH 7.4）中進行。循環伏安法掃描范圍為-0.2～0.8 V，掃描速率為100 mV/s；掃描頻率為0.01～106Hz，振幅為0.005 V，等待時間為2 s。

1.2.4反應條件優化

對免疫反應的條件，包括免疫反應時間和抗體用量進行了優化。孵育液中抗體量優化：在50 μL孵育液中，分別加入不同體積的抗體，每次孵育30 min，完成后用PBS沖洗，測差分脈沖伏安法峰電流，至峰電流基本不變時停止。

孵育時間優化：抗體量優化完成后，在50 μL孵育液中，加入上述最佳體積的抗體，將傳感器置入其中進行孵育，每5 min測一次DPV峰電流，至峰電流基本不變時停止。

1.2.5標準量品及實際量品檢測

將免疫傳感器浸于總體積為50 L的含有一系列質量濃度的β2-激動劑標準量品和固定用量抗體的孵育液中，37 ℃烘箱中恒溫孵育。完成后，用PBS緩沖液沖洗電極表面，置于含有2 mmol/L K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］的PBS中，采用DPV測定電流變化與β2-激動劑質量濃度的定量關系。

實際量品的加標分析：分別稱取（1±0.005） g的豬瘦肉、豬脂肪和豬肝（均為經過高效液相色譜法驗證過的陰性量品），每種實際量品各稱取3 份，加入定量的克倫特羅標準溶液。完成后，每份加入3 mL提取液乙腈-丙酮（1∶1，V/V），超聲提取20 min，4 000 r/min離心5 min，取上層清液用氮氣吹干，濃縮物用PBS溶解并定容至1 mL，采用DPV測定克倫特羅質量濃度。

2　結果與分析

2.1多殘留免疫傳感器原理

圖1　免疫傳感器的制備及檢測原理Fig.1 Schematic illustration forpreparation and application of the immunosensor

傳感器制備及免疫檢測原理如圖1所示，將制備完成的傳感器浸于孵育液中進行孵育，電極上固定的沙丁胺醇與溶液中游離的β2-激動劑競爭結合溶液中的定量抗體（圖1B中1過程），測定DPV峰電流Ix；以不含有β2-激動劑只含有抗體的孵育液為空白（圖1B中2過程），測定DPV峰電流I0。隨著溶液中游離β2-激動劑質量濃度的降低，與其結合的抗體相應減少，則結合到電極表面的抗體相應增加，對電子傳遞的阻礙隨之增強，因此DPV也隨之降低。將DPV峰電流之差值ΔI（ΔI=Ix-I0，Ix為量品檢測對應峰電流；I0為空白檢測對應峰電流）與β2-激動劑質量濃度建立定量關系，線性量合后即可得到工作曲線。

2.2石墨烯的表征

圖2　石墨烯分別分散在水中（A1）和殼聚糖溶液（A2）中以及石墨烯-殼聚糖的透射電子顯微鏡（B）Fig.2 Dispersed graphene in water （A1） and chitosan （A2）， and transmission electron microscopic observation of graphenechitosan dispersion （B）

石墨烯在水和殼聚糖溶液中分散狀態如圖2A所示，分散于水中的石墨烯經一段時間放置后即發生聚沉（圖2A1），分散于殼聚糖溶液中的石墨烯經過較長時間后依然均勻分散（圖2A2），表明殼聚糖對石墨烯在水中的分散起著重要作用［24］。圖2B為分散于殼聚糖溶液中的石墨烯的透射電子顯微鏡照片，其中石墨烯片層狀結構清晰可見，且片層以褶皺狀態存在并未完全鋪展開。褶皺可以降低單層石墨烯的表面能，增加其穩定性，阻止形貌由二維向三維轉變，是二維石墨烯存在的必要條件［25］。圖2B顯示出分散在殼聚糖中的石墨烯并未發生較大程度的團聚，表明殼聚糖對石墨烯具有很好的穩定作用［26］，與圖1結論一致。

2.3免疫傳感器的表征

由圖3A可以看出，沙丁胺醇標準溶液在223.6 nm和275.0 nm波長處有兩個特征吸收峰［27］，石墨烯-殼聚糖復合物在271.8 nm波長處有一個寬峰。石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇修飾層在223.6nm處出現一個“平臺狀”吸收峰，與沙丁胺醇標準溶液的吸收峰之一吻合完全，此外，該修飾層在273.4nm波長處出現的吸收峰應為石墨烯-殼聚糖復合物（271.8 nm）與沙丁胺醇（275.0 nm）的疊加所形成，說明沙丁胺醇已經成功修飾到電極上。

圖3B顯示處理干凈的裸電極有一對穩定、明顯的［Fe（CN）6］3-/［Fe（CN）6］4-氧化還原可逆峰（曲線a）。電極經過石墨烯-殼聚糖復合物修飾后，氧化還原電流響應較裸電極有明顯的升高（曲線b），這是由于石墨烯具有優異的導電性，大大加速了電極表面的電子傳遞。經過沙丁胺醇修飾后，傳感器的電流響應有微弱變化（曲線c），表明沙丁胺醇對電子傳遞速率的影響不大。傳感器經過抗體孵育后，循環伏安法峰電流又有明顯下降（曲線d），這是由于抗體與電極表面的沙丁胺醇可以特異性結合而被吸附到電極上，對電子傳遞產生明顯阻礙作用。上述循環伏安法曲線也可以表明沙丁胺醇已被成功修飾到電極上。

圖3C為交流阻抗譜圖，圖中曲線半圓部分的直徑為電子從［Fe（CN）6］3-/［Fe（CN）6］4-轉移到電極表面的阻抗值（Ret），該數值由電極表面材料的導電性能決定。裸玻碳電極的阻抗值約126 Ω（曲線a）；經石墨烯-殼聚糖修飾后，Ret幾乎為零（曲線b），表明電子在電極表面傳輸極快，這得益于石墨烯材料極高的電子傳遞速率；沙丁胺醇修飾并經過BSA封閉后電極阻抗值大約為600 Ω（曲線c）；抗體孵育后電極阻抗值大約為1600 Ω（曲線d）。由不同電極阻抗值可知，隨著沙丁胺醇、BSA的修飾以及抗體在電極表面的吸附，電極表面電子傳導的阻礙作用不斷增強，這也從另一個側面說明傳感器上材料修飾的成功。

圖3　電極修飾過程的紫外-可見吸收光譜（A）、循環伏安譜（B）和交流阻抗譜（C）圖Fig.3 Ultraviolet visible absorption spectra （A）， cyclic voltammetry spectrum （B） and electrochemical impedance spectrum （C） of the glassy carbon electrode during the modifying procedure

2.4反應條件優化

從圖4A可得，孵育液中抗體體積在1～5 μL范圍內時，峰電流隨抗體量增加而下降；在抗體體積為7 μL時，峰電流略有升高。表明抗體量為5 μL時抗體結合基本達到飽和，傳感器檢測效果達到最佳。故抗體量選擇為5 μL。

圖4B顯示，孵育時間在5～30 min范圍內時，峰電流隨孵育時間延長而下降；其后基本保持不變，表明當孵育時間為30 min時抗體結合基本達到飽和，傳感器檢測效果達到最佳。故選擇30 min為最佳孵育時間。

圖4　免疫優化反應抗體量（A）和孵育時間（B）的優化Fig.4 Optimization of immunoreaction conditions: antibody volume （A）and incubation time （B）

2.5β2-激動劑的多殘留檢測結果

在優化的條件下，進行β2-激動劑標準溶液的檢測，以峰電流差值ΔI與量品質量濃度建立線性關系，然后進行線性量合，建立標準曲線，見表1。

表1　石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇傳感器對沙丁胺醇、克倫特羅和特布他林的工作曲線Table 1 Standard curves for the detection of SAL， CL and TB

圖5　石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇修飾電極對沙丁胺醇（A）、克倫特羅（B）和特布他林（C）檢測的DPV檢測圖Fig.5 DPV spectra of reduced graphene oxide-chitosan composite/SAL modified electrode for the detection of SAL （A）， CL （B） and TB （C）

傳感器對3 種β2-激動劑檢測的DPV圖以及標準曲線如圖5所示，結果表明傳感器對克倫特羅、沙丁胺醇和特布他林的檢出限都較低，依次為0.2、0.3 ng/mL和0.3 ng/mL；線性相關系數除特布他林略低（R= 0.987）外，其余兩種都較高（R＞0.992），并且線性范圍都較寬。本實驗采用的寬譜特異性抗體為抗-SAL-RAC-BSA抗體，而沙丁胺醇與克倫特羅和特布他林都具有很大程度的相似結構，所以抗-SAL-RAC-BSA抗體對克倫特羅和特布他林具有一定的交叉反應性，因而能夠實現上述3 種β2-激動劑的同時檢測。遺憾的是，該傳感器未能檢測萊克多巴胺，原因可能是在動物免疫時，SAL-RACBSA抗原中萊克多巴胺結構部分未充分暴露于載體蛋白外部而喪失了其抗原決定簇的作用，導致獲得的抗-SALRAC-BSA抗體不能識別萊克多巴胺，從而最終影響了傳感器檢測效果。

2.6傳感器重復性和穩定性

傳感器制備完成后連續測定20 次電流響應，20 次結果相對標準偏差小于10%，表明所制備的石墨烯/殼聚糖/沙丁胺醇傳感器具有良好的重復性。將制備好的傳感器保存于4℃冰箱中，每天測定3 次電流響應，連續測定7 d，7 d測定結果相對標準偏差小于10%，表明該傳感器在相對較長時間內具有較好的穩定性。

2.7實際量品檢測結果

表2　石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇傳感器對實際樣品中克倫特羅的檢測結果Table 2 Analytical results for the determination of clenbuterol in real samples using graphene-chitosan/salbutamol sensor

表2為豬瘦肉、豬脂肪和豬肝3 種實際量品中加標克倫特羅的檢測結果，3 種量品的回收率都在84.7%～106%之間，相對標準偏差在3.7%～17.4%之間，表明傳感器對實際量品具有良好的檢測性。此外，豬瘦肉和豬脂肪的回收率稍差于豬肝，這可能是因為其中含有更大量的蛋白質和油脂等成分，因此對結果影響較大。

3　結 論

本實驗制備了石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇修飾的電化學免疫傳感器。在最優化條件下實現了對克倫特羅、沙丁胺醇和特布他林3 種β2-激動劑標準溶液的檢測，具有較低的檢出限（0.2～0.3 ng/mL）和較寬的線性范圍（依次為50～7 000、1～1 500 ng/mL和100～6 000 ng/mL）。將傳感器應用于豬瘦肉等實際量品中克倫特羅的檢測，擁有滿意的回收率（84.7%～106%）和較小的相對標準偏差（3.7%～17.4%），對實際量品檢測效果良好。

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Development of A Multi-Residue Electrochemical Immunoassay Based on Broad-Spectrum Specific Antibody for Determination of β2-Agonists

REN Pengfei1， SHAO Kefeng1， ZHANG Jie1， ZHANG Honglin2， ZHAO Bo1，*
（1. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Biomedical Functional Material， Jiangsu Key Laboratory of Biofunctional Materials，College of Chemistry and Materials Science， Nanjing Normal University， Nanjing 210023， China；2. College of Food Science， Nanjing Xiaozhuang University， Nanjing 211171， China）

Salbutamol-ractopamine-bovine serum albumin conjugate （SAL-RAC-BSA） was prepared and served as immunogen to obtain a broad-spectrum specific antibody （anti-SAL-RAC-BSA Abs） through immunization of rabbits. Electrochemical immunosensor modified with reduced graphene oxide-chitosan composite and SAL was constructed and its electrochemical behavior was studied by cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy. Indirect competitive electrochemical immunoassay was carried out for the simultaneous determination of three β2-agonis， including clenbuterol （CL）， salbutamol （SAL） and terbutaline （TB）. The proposed method indicated a linearity in the range from 50 to 7 000 ng/mL， 1 to 1 500 ng/mL and 100 to 6 000 ng/mL for CL， SAL and TB， respectively， and the limits of detection were 0.2， 0.3 and 0.3 ng/mL， respectively. The recovery rates of clenbuterol in spiked pork， fat and liver samples ranged from 84.7% to 106%. In summary， a sensitive， rapid and simple electrochemical immunoassay was successfully developed for the determination of three β2-agonists.

broad-spectrum specific antibodies； β2-agonists； multi-residue； electrochemical immunosensor

10.7506/spkx1002-6630-201608043

TS202.3

A

1002-6630（2016）08-0236-06

2015-10-12

任鵬飛（1987—），男，碩士，研究方向為食品安全分析與檢測。E-mail：905587856@qq.com

趙波（1969—），男，教授，博士，研究方向為食品安全檢測與預警。E-mail：zbchem@126.com

引文格式：