鵝細小病毒細胞適應株結構基因序列分析

王志強，劉力威，李洪彬，黃宇翔，楊旭東，鄒　躍，張　軍

（黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

鵝細小病毒細胞適應株結構基因序列分析

王志強，劉力威，李洪彬，黃宇翔，楊旭東，鄒躍，張軍

（黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

為了研究鵝細小病毒（GPV）YAN98分離株在鵝胚成纖維細胞（GEF細胞）中的適應及變異情況，試驗將YAN98毒株接種至GEF細胞中并連續傳代至F21代，利用分段PCR法擴增F21代細胞適應毒和親本病毒F0的結構基因序列，通過對測定序列進行剪輯、拼接，將F21代病毒結構基因序列與親本病毒序列進行比對，并推導氨基酸差異位點，分析遺傳變異性。結果表明，該病毒分離株已適應GEF細胞，并在72～96 h產生明顯的細胞病變，其F21代病毒效價為105.5TCID50。F21代病毒與親本病毒F0代結構基因中存在11個核苷酸差異，推導的氨基酸序列與親本病毒氨基酸序列比對差異不顯著，存在5個差異位點。

鵝細小病毒；細胞適應毒株；結構基因；序列分析

鵝細小病毒（GPV）是鵝細小病毒病的病原體，該病呈世界范圍流行，至今仍是危害養鵝業中最嚴重的傳染病，每年都有不同程度的流行，造成嚴重的經濟損失。GPV基因組大小為5 106 bp，含有2個開放閱讀框（ORF），左側ORF編碼非結構蛋白基因，右側ORF編碼結構蛋白基因，非結構基因和結構基因分別具有共同的羧基端及終止密碼子［1-3］。GPV的VP基因是刺激機體產生抗體的成分，同時與病毒的毒力及致病性密切相關。本試驗將GPV YAN98毒株接種在鵝胚成纖維細胞（GEF）中連續傳代至F21代，得到具有明顯細胞病變穩定的細胞毒。通過觀察細胞病變和測定細胞半數感染量（TCID50），確定YAN98病毒在GEF細胞中的適應性。在此基礎上，對F21代細胞適應毒和親本病毒F0代結構基因進行PCR擴增，得到結構基因全長，并進行序列的測定和比對，分析YAN98毒株在GEF細胞中的適應性及適應細胞后的變異情況，以期為分析鵝細小病毒在GEF細胞中的增殖及適應提供基礎。

1　材料與方法

1.1毒株及試驗動物鵝細小病毒YAN98分離株，是黑龍江省獸醫科學研究所第一研究室1998年自依安縣病例中分離鑒定的強毒株，經鵝胚傳至15代弱化。12日齡鵝胚及1日齡雛鵝均為鵝細小病毒非免疫本地白鵝卵孵化，鵝細小病毒瓊擴（AGP）抗體陰性。

1.2引物設計與合成參考Zadori等［4］發表的鵝細小病毒B株的基因序列，應用Oligo6軟件設計覆蓋鵝細小病毒結構蛋白基因的2對特異性引物。1號引物為VP3基因引物，VP3基因片段長度為1 605 bp，設計擴增長度為1 663 bp：2號引物為VP1-VP3非重疊區基因引物，VP1-VP3非重疊區基因片段長度為594 bp，設計擴增長度為880 bp。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列及擴增片段長度見表1。

表1　GPV結構蛋白基因PCR引物序列及擴增片段長度

表2　GPV結構基因PCR反應條件

1.3病毒在細胞中的適應及PCR檢測取20 h內形成完整單層的鵝胚成纖維原代培養細胞，棄去培養液，加入PBS緩沖液洗2次，吸出洗液，接入傳代毒種1 mL/中方瓶，37℃吸附培養1 h，棄去病毒吸附液，加入含8%FBS的新鮮DMEM營養液10 mL/中方瓶，同時設空白細胞對照兩瓶，37℃恒溫靜止培養5 d。反復凍融3次，將GEF細胞吹下，連同上清液一起，按上述方法接種病毒，連續盲傳，以提取的F1、F2、F3代細胞毒及空白對照的DNA為模板，以分別設計合成的2對引物作為VP3與VP1-VP3非重疊區基因的引物，利用PCR法檢測病毒。各片段PCR反應條件見表1-2。按下列順序加入各溶液建立50 μL PCR反應體系：2×PCR Taq Mix，25 μL：上游引物，2 μL：下游引物，2 μL：模板DNA，2 μL：ddH2O，19 μL。擴增完成后的PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察并記錄結果。

1.4TCID50的測定24孔板鵝胚成纖維細胞系1～3代細胞培養，20 h形成70%單層時用于接毒。將YAN98株F21代鵝胚成纖維細胞毒用DMEM做10倍倍比稀釋，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66個稀釋度接種培養，0.1 mL/孔，每稀釋度接四孔。37℃吸附培養1 h，棄吸附液，加含3%犢牛血清DMEM營養液，37℃靜止培養，120 h終判。按Reed-Muench兩氏法計算毒價。

1.5結構基因擴增F21代病毒液反復凍融3次后，按DNA抽提試劑盒說明書提取F21代細胞毒及F0代鵝胚尿囊液中的DNA，并以其為模板進行PCR擴增反應。反應體系和反應條件同上。PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用膠回收試劑盒回收PCR產物，將純化后的PCR產物連接pMD18-T載體，質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.6序列分析測得序列用DNAStar剪輯、拼接，再利用DNAStar軟件包中的Megalign軟件的Clustal W Method對F21序列與F0序列進行比對，分析核苷酸和氨基酸序列改變，根據核苷酸改變及推導的氨基酸位點改變分析YAN98株在GEF細胞中的適應及變異情況。

2　結果

2.1病毒在細胞中的適應及PCR檢測結果對細胞毒感染5 d的GEF進行形態學觀察，發現GEF細胞接種F21代細胞毒后72 h出現明顯細胞病變，主要表現為細胞變圓，皺縮，單層細胞出現空隙直至從瓶壁脫落：同時培養的正常GEF細胞未出現明顯的形態學變化。以F1、F2、F3、F4、F5代細胞毒及空白對照提取的DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，目的條帶為1 663 bp。結果見圖1。

圖1　PCR擴增結果

2.2TCID50檢測結果將YAN98株鵝胚成纖維細胞毒按照連續10倍倍比稀釋，每個稀釋度接種6個細胞孔，觀察并統計細胞病變孔數，按照Reed-Muench法計算TCID50，得到F21代細胞毒的病毒效價為105.5TCID50。

2.3核苷酸序列分析結果以F21代病毒細胞裂解液提取的DNA為模板，用2對引物進行PCR擴增得到2個片段，大小與預期結果相符。將測得的2個片段進行序列剪輯、拼接。本試驗選用的病毒株結構蛋白分別為VP1、VP2、VP3，其中VP1包含所有VP2和VP3的核苷酸序列，它們含有相同的羧基端［2-3］。本試驗對F21代病毒與親本病毒F0代進行序列比對，結果表明，F21代與F0代結構基因存在11個核苷酸差異位點，編碼區不存在堿基的插入與缺失。

2.4氨基酸序列差異分析結果將GPV細胞毒F21代與親本病毒F0代推導的氨基酸序列進行比較，結果表明，F21代與F0代存在5個氨基酸差異位點，見表3。

3　討論

GPV在GEF細胞中的病毒效價在F21代達到105.5TCID50，并且將GEF細胞接種F12代細胞毒72 h后出現明顯細胞病變，這些表明GPV已經適應GEF細胞。本試驗采用分段PCR的方法擴增得到結構基因，包含1個開放閱讀框，編碼結構蛋白，包括VP1、VP2和VP3，大小分別為2 199 bp、1 764 bp和1 605 bp，分別編碼732，587，534個氨基酸。

表3　VP蛋白氨基酸突變位點比較

縱觀整個細小病毒科基因組研究發現，所有細小病毒科成員基因組結構非常相似，都是由結構蛋白基因和非結構蛋白基因兩部分組成，而且非結構基因序列同源性非常高，非常保守，而結構蛋白基因序列是變異相對較大的部分，因此推測細小病毒的結構蛋白基因序列可能是決定病毒毒力及組織嗜性的關鍵部位［4］。

VP3蛋白是主要的衣殼蛋白，VP2也參與衣殼蛋白的形成。VP3是GPV的主要免疫保護性抗原，能夠誘導機體產生具有中和作用的抗體。VP1可協助病毒或其DNA通過核孔轉運至細胞核內，可與宿主細胞的特殊受體結合，使病毒粒子進行有效感染［1-2］。

研究將測得的F21代結構基因序列與F0代進行比對分析，結果表明，有11個核苷酸差異位點，其中6個位于VP1，5個位于VP3，這些核苷酸改變，也可能對病毒適應細胞過程起到重要作用。根據測得的F21代結構基因序列推導的氨基酸序列與原代毒株F0代推導的氨基酸序列進行比對，發生5個氨基酸位點改變，這種改變可能對病毒毒力有影響：另一方面，VP1、VP2和VP3基因編碼氨基酸的改變可能在病毒適應細胞過程中發揮重要的作用。

［1］邱娜，邵周伍林，白小飛，等.鵝細小病毒細胞適應毒株基因序列分析［J］.黑龍江畜牧獸醫，2014，10：25-28.

［2］Brown K E，Green S W，Young N S.Goose parvovirus-an autonomous member of the dependovirus genus［J］.Virology，1995，210（2）：283-291.

［3］Smith D H，War D P，Linden R M.Comparative characterization of rep proteins from the helper-dependent adeno-associated virus type 2 and the autonomous goose parvovirus［J］.J Viol，1999，73（4）：2930-2937.

［4］Zadori Z，Stefancsik R，Rauch T，et al.Analysis of the complete nucleotide sequences of goose and Muscovy duck parvoviruses indicates common ancestral origin with adenoassociated virus 2［J］. Virology，1995，212（2）：562-573.

S852.65

A

0529-6005（2016）09-0040-02

2015-10-29

王志強（1977-），女，助理研究員，碩士，研究方向為預防獸醫方向，E-mail：zhiqiang92@hotmail.com