洛氏鱥非脫羧勒克菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

巴翠玉，趙福廣，張培軍，張林波，王建超，李月紅

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春 130000）

洛氏鱥非脫羧勒克菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

巴翠玉1，趙福廣1，張培軍2，張林波1，王建超1，李月紅1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春 130000）

本試驗(yàn)旨在從患病洛氏鱥的鰓及內(nèi)臟等病灶部位分離病原菌，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。采用革蘭染色的方法觀察其為短桿狀、兩端鈍圓的革蘭陰性菌，利用法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定及藥敏試驗(yàn)分析，結(jié)果為非脫羧勒克菌，其對(duì)阿米卡星和亞胺培南等21種藥物敏感。后進(jìn)行回歸試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)死亡率為54.4%危害較大。因魚(yú)類(lèi)中發(fā)現(xiàn)非脫羧勒克菌較少，所以本文對(duì)于魚(yú)類(lèi)非脫羧勒克菌的研究有重要意義。

洛氏鱥；非脫羧勒克菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

洛氏鱥在魚(yú)類(lèi)分類(lèi)學(xué)上屬鯉形目、鯉科、雅羅魚(yú)亞科、鱥屬，漁民常稱(chēng)為柳根池［1-3］。主要分布于新疆北部、黑龍江及吉林流域。因其抗寒性強(qiáng)、食性雜、適應(yīng)范圍廣，適合大規(guī)模養(yǎng)殖。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，各種病害也層出不窮，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，但關(guān)于洛氏鱥疾病研究的報(bào)道卻很少。非脫羧勒克菌是勒克菌屬中惟一的菌種，是一種條件致病菌，隨著臨床上的報(bào)道增多而被人們關(guān)注［4］。被從人類(lèi)的血液、腹瀉患者糞便和腹膜透析液中檢出，在食品及藥品中也有發(fā)現(xiàn)，但是在魚(yú)類(lèi)及其他動(dòng)物中報(bào)道較少。2004年黃寧［5］等從馬尾口岸飼料用魚(yú)粉中檢出4株非脫羧勒克菌。2014年劉溪源［6］等從牛患乳房炎乳樣中檢出非脫羧勒克菌。目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道非脫羧勒克菌對(duì)洛氏鱥的危害。本試驗(yàn)從患病洛氏鱥中分離到一株非脫羧勒克菌，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選了防治藥物，為預(yù)防和治療非脫羧勒克菌引起的洛氏鱥類(lèi)疾病提供了一定的參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料試驗(yàn)用發(fā)病洛氏鱥，采自吉林省某漁場(chǎng)，癥狀表現(xiàn)為腹部腫脹。剖檢魚(yú)，發(fā)現(xiàn)鰓上有黏稠狀粉紅色液體，有的鰓絲發(fā)白，膽囊腫大呈墨綠色，肝胰臟充血。試驗(yàn)用健康洛氏鱥，購(gòu)自吉林省金龍漁場(chǎng)。

1.2方法

1.2.1病原菌的分離在無(wú)菌的超凈工作臺(tái)上將具有典型自然發(fā)病癥狀的瀕死洛氏鱥，用75%酒精棉球反復(fù)擦拭體表，無(wú)菌操作取其鰓部及內(nèi)臟等病灶部位，制成勻漿。將勻漿稀釋成不同濃度，用微量移液器取200 μL勻漿，涂布棒涂布到麥康凱瓊脂平板上，30℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)。挑取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行多次劃線純培養(yǎng)，待菌落形態(tài)生長(zhǎng)一致時(shí)，挑取單菌落用80%甘油對(duì)其進(jìn)行菌落的保藏，為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.2.2病原菌的鑒定

1.2.2.1革蘭染色法無(wú)菌條件下潔凈的載玻片滴少許生理鹽水，用接菌環(huán)將分離純化后的菌株均勻的涂布到載玻片上，干燥固定，后用結(jié)晶紫染液初染、碘液煤染、酒精脫色、番紅染液復(fù)染后鏡檢。

1.2.2.2生化鑒定采用法國(guó)梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，鑒定板為革蘭陰性菌鑒定板，結(jié)合生物梅里埃公司的API-細(xì)菌鑒定系統(tǒng)API20E進(jìn)行生化反應(yīng)測(cè)試。試驗(yàn)周期結(jié)束后觀察試驗(yàn)結(jié)果并分析。

1.2.2.3藥物敏感試驗(yàn)采用法國(guó)梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，鑒定板為革蘭陰性菌藥敏板，試驗(yàn)周期結(jié)束后觀察試驗(yàn)結(jié)果并分析。

1.3.2.4回歸試驗(yàn)將分離的菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，30℃培養(yǎng)16 h后制成菌懸液，調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/mL，進(jìn)行人工感染以確定病原菌。選用馴化后的體格健壯、規(guī)格整齊、游動(dòng)活躍，平均初體重為（35±0.5）g的當(dāng)年洛氏鱥120尾。隨機(jī)分為4組，1組對(duì)照組，其余3組為試驗(yàn)組。將4組魚(yú)同時(shí)放入相同水環(huán)境不同魚(yú)缸中。通過(guò)腹腔注射法進(jìn)行攻毒，對(duì)照組每條魚(yú)注射無(wú)菌生理鹽水0.1 mL，試驗(yàn)組每條魚(yú)注射菌懸液0.1 mL。22℃水溫下飼養(yǎng)7 d，觀察洛氏鱥發(fā)病及死亡狀況，并記錄。再取病死洛氏鱥的鰓及內(nèi)臟等病灶部位進(jìn)行病原菌的分離及鑒定。

2　試驗(yàn)結(jié)果

2.1病原菌分離及革蘭染色結(jié)果從發(fā)病洛氏鱥的病灶部位分離出1株優(yōu)勢(shì)菌株，30℃培養(yǎng)24 h，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上菌落呈圓形，光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，中央微隆起，半透明，乳白色。顯微鏡下可以觀察到顏色為紅色，桿狀，兩端鈍圓，單個(gè)排列，為革蘭陰性菌，結(jié)果如圖1。

圖1　革蘭染色結(jié)果

2.2生化鑒定結(jié)果結(jié)果如表1，經(jīng)過(guò)法國(guó)梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，可知該菌與側(cè)金盞花醇、D-葡萄糖和D-甘露糖等21項(xiàng)指標(biāo)反映呈陽(yáng)性，與蔗糖、組氨酸同化和氨基乙酸芳胺酶等25項(xiàng)指標(biāo)反映呈陰性。綜上所述，參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第8版），確定菌株為非脫羧勒克菌，鑒定可信度為99%。

表1　藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過(guò)法國(guó)梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表2，藥敏試驗(yàn)判定參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)VET01-A4標(biāo)準(zhǔn)［7］，這株菌對(duì)氨芐西林、安曲南及其他19種藥物全部敏感。

2.4回歸試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果如表2，分離菌株注射感染24 h后，洛氏鱥開(kāi)始食量下降，游動(dòng)遲緩，3 d后開(kāi)始出現(xiàn)死亡。7 d后，對(duì)照組一切正常，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)死亡；注射濃度為1×108CFU/mL的菌懸液0.1 mL的3個(gè)試驗(yàn)組中洛氏鱥的死亡率為54.4%。分別從3個(gè)試驗(yàn)組各隨機(jī)挑取一條感染死亡的洛氏鱥，癥狀表現(xiàn)為腹部腫脹。剖檢魚(yú)，發(fā)現(xiàn)鰓上有黏稠狀粉紅色液體，有的鰓絲發(fā)白，膽囊腫大呈墨綠色，肝胰臟充血。取其內(nèi)臟及鰓等病灶部位進(jìn)行細(xì)菌的再分離，對(duì)分離出的菌株進(jìn)行革蘭染色和生理生化鑒定，結(jié)果同從自然發(fā)病魚(yú)體分離的株菌完全一致為非脫羧勒克菌，證明非脫羧勒克菌是該次疾病的病原菌。

表2　回歸試驗(yàn)結(jié)果

3　討論

本試驗(yàn)首次從患病洛氏鱥分離出非脫羧勒克菌，該菌使洛氏鱥腹部腫脹。剖檢魚(yú)，發(fā)現(xiàn)鰓上有黏稠狀粉紅色液體，有的鰓絲發(fā)白，膽囊腫大呈墨綠色，肝胰臟充血。30℃條件下培養(yǎng)24 h該菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上菌落呈圓形，光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，中央微隆起，半透明，乳白色。與宋燕［8］等從腹透液中分離到的非脫羧勒克菌在麥康凱培養(yǎng)皿上菌落形態(tài)有所不同。原因可能為不同源分離到的非脫羧勒克菌故在麥康凱培養(yǎng)皿上有所差異，也可能為培養(yǎng)的溫度及時(shí)間等條件不同所以菌落形態(tài)存在差異。革蘭染色結(jié)果為桿狀，兩端鈍圓，單個(gè)排列的革蘭陰性菌，此結(jié)果和梁炯芳［9］的基本相同。

生化鑒定結(jié)果得到該菌與側(cè)金盞花醇、D-葡萄糖和D-甘露糖等指標(biāo)反映呈陽(yáng)性，表明該菌能發(fā)酵或利用這些物質(zhì)；與蔗糖、組氨酸同化和氨基乙酸芳胺酶等指標(biāo)反映呈陰性。確定菌株為非脫羧勒克菌，鑒定可信度為99%。與陳燕［10］等同樣用法國(guó)梅里埃公司VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果相同。

回歸試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其死亡率達(dá)54.4%，對(duì)魚(yú)類(lèi)危害嚴(yán)重。本試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)亞胺培南、美洛培南、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星等21種藥物高度敏感。與吳堯蘭［11］等從腹膜透析液中檢出非脫羧勒克菌1例的藥敏結(jié)果相符合。與王遷［12］等從血液標(biāo)本中分離到的1株非脫羧勒克菌藥敏結(jié)果有些差異。沒(méi)有產(chǎn)生耐藥性的原因可能是因?yàn)轲B(yǎng)殖過(guò)程中沒(méi)有大量的使用抗生素藥物，而且不同地區(qū)、不同源的非脫羧勒克菌的藥物敏感程度也是有差異的，所以我們?cè)谟盟帟r(shí)應(yīng)根據(jù)發(fā)病區(qū)菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果來(lái)進(jìn)行用藥或用一些中草藥和益生菌制劑來(lái)預(yù)防魚(yú)病的發(fā)生，避免耐藥性的產(chǎn)生。本試驗(yàn)最終確定該病原菌為非脫羧勒克菌，但該菌的耐藥性機(jī)制還未徹底研究清楚，耐藥基因存在于質(zhì)粒或染色體上我們還不清楚，可不可以結(jié)合方式在各菌種、動(dòng)物及人類(lèi)之間傳播均有待于進(jìn)一步的探究，本試驗(yàn)對(duì)吉林省非脫羧勒克菌感染洛氏鱥發(fā)病的治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)，對(duì)其養(yǎng)殖具有一定的指導(dǎo)，可為后面的研究提供一定的參考，具有一定的理論意義。

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Isolation，identification and drug sensitivetest ofLeclercia adecarboxylatafromPhoxinus lagowskii Dybowskii

BA Cui-yu1，ZHAO Fu-guang1，ZHANG Pei-jun2，ZHANG Lin-bo1，WANG Jian-chao1，LI Yue-hong1
（1.Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Jilin Province Health Surveillance Inspection Center，Changchun 130000，China）

The purpose of this experiment was to isolate pathogenic bacteria from Lesion of gill and viscera of the diseased of Phoxinus lagowskii Dybowskii，and to identify them.The Gram staining method was used to observe the short and rounded at both ends of the gram negative.The production of the French Merieux VITEK 2 compact automatic bacteria identification system was applied for biochemical identification and susceptibility test analysis.The results showed that the bacteria were Leclercia adecarboxylata and were sensitive to 21 kinds of drugs including imipenem and amikacin.After the regression test，the mortality rate was 54.4%.Leclercia adecarboxylata found in fish was rare.Thus，our findings about fish Leclercia adecarboxylat is important.

Phoxinus lagowskii Dybowskii；Leclercia adecarboxylata；isolation and identification；drug sensitivity test

LI Yue-hong

R 37

A

0529-6005（2016）09-0099-03

2016-01-18

國(guó)家自然科學(xué)基金（30972191）；農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目（2014Z34）；吉林省留學(xué)人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201523）

巴翠玉（1992-），女，碩士，主要從事分子病原微生物學(xué)與分子免疫學(xué)研究E-mail：bacuiyu@163.com

李月紅，E-mail：liyhong@sina.com