山慈菇多糖對(duì)H22肝癌小鼠IL-2及p53蛋白表達(dá)的影響

徐小娟，周志涵，毛宇，徐芳，李杰，賀建華

（1.湖南省醫(yī)藥技工學(xué)校，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

山慈菇多糖對(duì)H22肝癌小鼠IL-2及p53蛋白表達(dá)的影響

徐小娟1，2，周志涵1，毛宇2，徐芳2，李杰2，賀建華3，*

（1.湖南省醫(yī)藥技工學(xué)校，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

研究山慈菇多糖對(duì)H22的體內(nèi)抑制作用及其機(jī)制。建立小鼠H22腹水瘤和實(shí)體瘤模型觀察山慈菇多糖的抑瘤作用，Elisa檢測(cè)實(shí)體瘤小鼠外周血IL-2水平，HE染色法觀察小鼠腫瘤組織的細(xì)胞形態(tài)，SABC免疫組化法檢測(cè)p53蛋白表達(dá)情況。能改善腹水瘤小鼠的生存狀態(tài)和延長(zhǎng)生存天數(shù)，延長(zhǎng)率為21.4％。實(shí)體瘤小鼠低、中、高劑量組抑瘤率分別為21.58％、32.76％、40.05％，IL-2的中高劑量組相對(duì)模型組都具有極顯著性（P＜0.01），增強(qiáng)了p53蛋白的表達(dá)水平。山慈菇多糖延長(zhǎng)了腹水瘤小鼠生存時(shí)間，解剖觀察可能是減少小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)；實(shí)體瘤小鼠此次試驗(yàn)中呈現(xiàn)了一定的劑量依賴性，其機(jī)制可能與提高小鼠IL-2含量從而提高小鼠免疫力有關(guān)，p53隨著腫瘤細(xì)胞分化程度下降而表達(dá)增加。

山慈菇多糖；小鼠肝癌H22；抗腫瘤；IL-2；p53

多糖是一類由單糖聚合而成的多聚糖，目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種多糖具有抗癌、抗氧化、抗衰老、降低血糖和提高免疫力等作用［1］。“山慈菇”的原植物是來(lái)源于杜鵑蘭Cremastra appendiculata（D.Don）Makino［2］，其始見(jiàn)于《本草拾遺》［3］，為中國(guó)藥典3收載的少常用中藥，在民間常與其它中藥配伍被用作抗腫瘤藥物。本實(shí)驗(yàn)的山慈菇為蘭科植物獨(dú)蒜蘭云南獨(dú)蒜蘭Pleione yunnanensis Rolfe Polysaccharides的干燥假鱗莖，習(xí)稱“冰球子”假鱗莖入藥，稱“山慈菇”或“毛慈菇”，藥材又稱毛慈菇，其味甘、微辛、寒、歸肝、脾經(jīng)，具有清熱解毒、消癰散結(jié)的功效，中醫(yī)臨床上常用于治療淋巴結(jié)核，乳腺癌、食管癌、胃癌等惡性腫瘤，以及蛇、蟲、狂犬咬傷［4］，降壓［5］。代芳應(yīng)用補(bǔ)益理氣藥配伍山慈菇，治療甲狀腺腺瘤，腫塊明顯縮小［6］，以山慈菇配伍他藥治療原發(fā)性肝癌，能解毒散結(jié)，延長(zhǎng)患者生命［7］。肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）（簡(jiǎn)稱肝癌）是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中列第三位［8］。目前治療肝癌仍以手術(shù)及化療為主，但化療易引起的肝腎毒性等不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)選用小鼠肝癌H22細(xì)胞是最常用的小鼠可移植性腫瘤細(xì)胞系之一，廣泛應(yīng)用于小鼠腫瘤動(dòng)物模型的復(fù)制。山慈菇多糖抗腫瘤的機(jī)制極少報(bào)道，因此我們對(duì)山慈菇多糖誘導(dǎo)鼠源性H22肝癌細(xì)胞凋亡的抗腫瘤機(jī)制作一研究。

1　方法

1.1H22細(xì)胞的培育

將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106，反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液。取0.2mLH22細(xì)胞懸液注射至小鼠腹腔，8天后腹水小鼠腹部似母鼠，精神狀態(tài)、毛色、進(jìn)食稍差。為避免出現(xiàn)血性腹水，在第8天將小鼠頸椎脫臼處死，浸至75％乙醇，濾干于超凈工作臺(tái)使用一次性5mL注射器斜扎入腹腔將腹水取出，轉(zhuǎn)存至已滅菌的15mL離心管，腹水為乳白色，如顏色偏紅，應(yīng)棄之。將腹水1 200 r/min離心5min，棄上清，將細(xì)胞加0.9％生理鹽水按1∶3（體積比）稀釋，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，0.9％生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106，用移液槍反復(fù)吹打、水平振搖成細(xì)胞懸液。

1.2多糖溶液的配置

山慈菇多糖（Pleione yunnanensis Rolfe polysaccharides，PYRP）純度為80％：購(gòu)于陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司。山慈菇多糖，根據(jù)各組劑量，置10mL離心管中用0.9％生理鹽水配置成溶液，灌胃小鼠后放于冰箱4℃冷藏，考慮藥效，隔日重新配置新鮮山慈菇多糖溶液。

1.3動(dòng)物模型建立

1.3.1實(shí)體瘤模型建立

昆明雌性小鼠60只，喂養(yǎng)3 d適應(yīng)環(huán)境，約22 g～25 g，每只小鼠右腋窩下以75％乙醇消毒，皮下注射H22肝癌細(xì)胞1×106懸液0.2mL，接種后出現(xiàn)米粒大小的皮丘為接種成功。

1.3.2腹水瘤肝癌模型建立

將30只22g～25g昆明小鼠，每只小鼠腹腔以75％乙醇消毒，注射H22肝癌細(xì)胞1×106懸液0.2mL。腹水型肝癌H22小鼠分組及劑量：昆明雌性小鼠30只，喂養(yǎng)3 d適應(yīng)環(huán)境。

1.4分組及劑量

1.4.1實(shí)體瘤肝癌模型

分組及劑量：空白組不接種，接種了H22肝癌細(xì)胞的小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。山慈菇多糖高劑量組400mg/kg溶液0.2mL，山慈菇多糖中劑量組200mg/kg溶液0.2mL，山慈菇多糖低劑量100mg/kg溶液0.2mL，模型組0.9％無(wú)菌生理鹽水0.2mL，陽(yáng)性組腹腔注射環(huán)磷酰胺20mg/kg溶液0.2mL，正常組0.9％無(wú)菌生理鹽水0.2mL。

1.4.2腹水瘤肝癌模型

分組及劑量：隨機(jī)將腹水瘤肝癌小鼠分為以下3組，每組10只。山慈菇多糖組400mg/kg，模型組0.9％無(wú)菌生理鹽水0.2mL，環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺40mg/kg溶液0.2mL。

1.5給藥

1.5.1實(shí)體瘤肝癌模型

腫瘤移植的當(dāng)天記為0天。注射48 h后，將山慈菇多糖溶液按高、中、低劑量各組小鼠連續(xù)用藥13 d。每隔1天為小鼠稱重并觀察小鼠生存狀態(tài)，在第5天可見(jiàn)實(shí)體瘤體積有接種時(shí)米粒般大小長(zhǎng)成黃豆般大小，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腋下腫瘤的長(zhǎng)和寬。

1.5.2腹水瘤肝癌模型

腫瘤移植的當(dāng)天記為0天。注射48 h后，將山慈菇多糖溶液400mg/kg給山慈菇多糖組小鼠灌胃給藥，環(huán)磷酰胺組小鼠腹腔注射20mg/kg環(huán)磷酰胺，模型組灌胃0.9％生理鹽水。每隔1天為小鼠稱重并觀察小鼠生存狀態(tài)，在第5天可見(jiàn)小鼠腹部逐漸隆起，在第7天可觀察到小鼠腹部明顯腹水。

1.6檢測(cè)指標(biāo)

1）實(shí)體瘤連續(xù)給藥13 d，末次給藥24 h后，給小鼠稱體重、拍照、眼眶采血，3 000 r/min離心10min制備血清，Elisa試劑盒檢測(cè)血清中IL-2、TNFα的活性，用75％乙醇浸泡10 s后剝?nèi)⌒∈罅鼋M織、肝臟、脾臟、胸腺稱重，瘤組織和肝臟拍照并稱重，將瘤組織浸入4％多聚甲醛固定液中密封，石蠟包埋，連續(xù)切片，免疫組化SABC法檢測(cè)腫瘤組織蛋白p53的表達(dá)。

2）腹水型小鼠持續(xù)給藥，觀察生存狀態(tài)及生存時(shí)間。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果及分析

2.1對(duì)實(shí)體瘤小鼠體重增長(zhǎng)狀況、腫瘤生長(zhǎng)曲線及抑瘤率、脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)的影響

2.1.1實(shí)體瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線

荷H22小鼠實(shí)體瘤生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。

圖1　荷H22小鼠實(shí)體瘤生長(zhǎng)曲線Fig.1 H 22 tum or-bearingm ice solid tum or grow th chart

第5天開始測(cè)量小鼠實(shí)體瘤體積，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腋下腫瘤的長(zhǎng)和寬，根據(jù)公式計(jì)算實(shí)體瘤體積。

實(shí)體瘤體積=長(zhǎng)×寬2/2

由表1可以看出生理鹽水對(duì)照組小鼠腋下腫塊生長(zhǎng)速度較快，從飲食、活動(dòng)及毛發(fā)色澤來(lái)看，山慈菇多糖中、高劑量小鼠生存質(zhì)量明顯高于環(huán)磷酰胺組及山慈菇低劑量組。環(huán)磷酰胺組在后期體重增長(zhǎng)明顯低于山慈菇多糖各劑量組。

2.1.2對(duì)實(shí)體瘤小鼠體重、瘤質(zhì)量的影響

各組小鼠給藥前后體重變化、瘤質(zhì)量見(jiàn)表1。

表1　各組小鼠給藥前后體重變化、瘤質(zhì)量Table1 Groupsofm icewithW eight changebeforeand after dosing、Quality of tumor

根據(jù)表1數(shù)據(jù)可看出，給藥前小鼠的體重差別不大，給藥后中劑量組的小鼠體重最接近于正常組，環(huán)磷酰胺組小鼠體重明顯低于各組。模型組小鼠體重明顯比其他各劑量組重，模型組相比其它小鼠腫瘤質(zhì)量重且伴隨積水，從而使模型組小鼠總體重增加。

2.1.3對(duì)實(shí)體瘤小鼠抑瘤率、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及IL-2表達(dá)的影響

各組小鼠抑瘤率、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)見(jiàn)表2。

表2　各組小鼠抑瘤率、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)Table2 Groupsofm icew ith tum or inhibition rateand the index of thym us，spleen weight

由表2可知，山慈菇多糖低、中、高劑量組對(duì)小鼠肝癌H22實(shí)體瘤的抑制率分別為21.58％、32.76％、40.05％，經(jīng)SPSS18.0分析，與模型組比較，高、中劑量組具有極顯著差異（P＜0.01），環(huán)磷酰胺組抑制率達(dá)到81.52％，與模型組比較具有極顯著差異（P＜0.01），且與山慈菇多糖各劑量組相比，抑制腫瘤作用較強(qiáng)。

2.1.4觀察瘤組織

模型組：瘤組織體積較環(huán)磷酰胺組大，形狀不規(guī)則，部分有包膜覆蓋，顏色相對(duì)周圍肌肉組織淺，部分向肌肉浸潤(rùn)生長(zhǎng)，瘤周有較大面積的水腫、出血，腫瘤切面中有較多新生微血管壞死出血。

環(huán)磷酰胺組：瘤組織為橢圓形或呈不規(guī)則形狀，包膜大部分完整，體積明顯小于模型組和山慈菇多糖組，瘤組織呈魚肉色，切面色白，出血很少。

山慈菇多糖實(shí)驗(yàn)組：瘤組織呈橢圓形或不規(guī)則形狀，大部分包膜明顯，個(gè)別有向肌肉組織浸潤(rùn)現(xiàn)象，瘤組織顏色呈魚肉色，切面較模型組出血較少。

2.1.6HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果見(jiàn)圖2～圖6。模型組（圖2）中，細(xì)胞核深染、排列致密，與其相比較，其山慈菇多糖低、中、高用藥組（圖3、4、5）的瘤組織中，癌細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減少，細(xì)胞核淡染、固縮或者散落成碎片，高劑量組（圖5）更為明顯。環(huán)磷酰胺組（圖6）的效果相比山慈菇多糖各用藥組，細(xì)胞多固縮及散落成碎片，效果最為明顯。

圖2　模型組Fig.2 Modelgroup

圖3　低劑量組Fig.3 Low dosegroup

圖4　中劑量組Fig.4 M edium dosegroup

圖5高劑量組Fig.5 High dosegroup

圖6　環(huán)磷酰胺組Fig.6 Cyclophospham idegroup

2.1.7免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察p53蛋白表達(dá)

在臨床病理診斷中，免疫組織化學(xué)（IHC）是一種很重要的技術(shù)和手段，免疫組化技術(shù)就應(yīng)用于病理診斷，對(duì)于診斷腫瘤“腫瘤分類”判斷預(yù)后產(chǎn)生了巨大的影響［9］，本實(shí)驗(yàn)采用的SABC（StreptAvidin—Biotin Complex，簡(jiǎn)稱SABC）是目前檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡的常用而準(zhǔn)確的方法之一［10］，人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因，包括抑癌基因和原癌基因兩大類。p53基因被認(rèn)為是目前最重要的抑癌基因［11］，在DNA復(fù)制、修復(fù)、重組及細(xì)胞周期調(diào)控中都起到重要作用，其細(xì)胞凋亡通路是人類腫瘤發(fā)生過(guò)程中最常改變的通路［8］，該通路中p53蛋白發(fā)揮細(xì)胞周期調(diào)控和DNA修復(fù)功能。p53陽(yáng)性的癌細(xì)胞呈棕褐色與周圍未著色的正常細(xì)胞形成對(duì)照，很容易在鏡下識(shí)別。p53蛋白在多糖組中的表達(dá)率高于模型組，圖像數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析將下一步進(jìn)行，說(shuō)明山慈菇抑制腫瘤可能是通過(guò)p53抑癌基因發(fā)揮作用。免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察p53蛋白表達(dá)見(jiàn)圖7～圖9。

圖7　模型組Fig.7 M odelgroup

圖8　多糖組Fig.8 Polysaccharidegroup

圖9　環(huán)磷酰胺組Fig.9 Cyclophospham idegroup

2.2對(duì)腹水型小鼠生存狀態(tài)及生存期影響比較

模型組小鼠在第6天左右腹腔明顯膨大，至第8天生存狀態(tài)良好，腹部逐日變大，第9天開始毛發(fā)開始枯萎、松散，精神狀態(tài)欠佳，活動(dòng)能力下降，進(jìn)食量稍減，第13天出現(xiàn)小鼠死亡，平均生存14 d。

環(huán)磷酰胺組7天后開始毛發(fā)枯萎稀疏，無(wú)光澤，嘴巴烏紫、進(jìn)食量逐日減少，在第13天出現(xiàn)死亡，第14天多數(shù)死亡，平均生存天數(shù)14 d。

山慈菇多糖組：灌胃山慈菇多糖400mg/kg，在第8天生存狀態(tài)良好，9天后開始毛色無(wú)光澤，活動(dòng)能力下降，進(jìn)食量逐漸減少，在第13天無(wú)死亡現(xiàn)象，第14天出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，平均生存天數(shù)17 d。

根據(jù)公式［11］生命延長(zhǎng)率（ILS）/％=T-C/C×100

式中：T為治療組，C為模型組。

相對(duì)模型組，山慈菇多糖組可使腹水型小鼠生命延長(zhǎng)21.4％。且根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程觀察可得出山慈菇多糖可改善H22腹水型小鼠的生存狀態(tài)。

3　結(jié)論

1）環(huán)磷酰胺和山慈菇多糖可不同程度地抑制H22荷瘤小鼠實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率是衡量一種藥物抗腫瘤有效性的最基本和最重要的一個(gè)指標(biāo)，是在進(jìn)行抗腫瘤藥物篩選時(shí)的主要依據(jù)，《現(xiàn)代腫瘤治療藥物學(xué)》關(guān)于抗腫瘤中草藥有效性的標(biāo)準(zhǔn)是抑瘤率＞30％［12］。化學(xué)藥物環(huán)磷酰胺的效果最好，在山慈菇多糖的中、高劑量組的效果較為明顯，達(dá)到了32.76％和40.05％，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，可初步認(rèn)為山慈菇多糖有一定的抗腫瘤作用。但腹水瘤小鼠的生存期卻無(wú)顯著性提高，這可能與癌細(xì)胞在腹腔內(nèi)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移速度更快、毒性更強(qiáng)有關(guān)［13］。

2）相對(duì)環(huán)磷酰胺用藥組，山慈菇多糖組荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)下降不明顯，無(wú)體質(zhì)量減輕，表明山慈菇多糖對(duì)小鼠機(jī)體的毒副作用小。

3）細(xì)胞因子（cytokine）有造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)或炎癥反應(yīng)中的活化細(xì)胞產(chǎn)生，能調(diào)節(jié)細(xì)胞分化增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)揮功能，可作為惡性腫瘤生長(zhǎng)的直接調(diào)節(jié)劑，可以殺傷腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞［14］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-2是機(jī)體抗癌、抗病毒的主要參與者［15］。山慈菇多糖可以提高小鼠IL-2、TNFα的活性，中、高劑量組較為明顯，這可能與山慈菇多糖能提高或保持荷瘤小鼠體內(nèi)TNF-α含量，減少荷瘤小鼠的炎癥反應(yīng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮毒性作用有關(guān)［16］，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，多糖各劑量組荷瘤小鼠生理狀態(tài)較好，食量、水量、活動(dòng)量較模型、對(duì)照組強(qiáng)，初步揭示了其抑瘤機(jī)理之一，可能與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。

4）HE染色各種組織或細(xì)胞病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)均可顯示出來(lái)，本實(shí)驗(yàn)在光鏡下觀察瘤組織的染色切片中發(fā)現(xiàn)，山慈菇多糖給藥組切片相對(duì)于模型組癌細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減少，細(xì)胞核淡染、固縮或者散落成碎片，細(xì)胞形態(tài)各異，著色深淺不一，提示了山慈菇多糖有誘導(dǎo)小鼠肝癌H22細(xì)胞凋亡的作用。

5）本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示多糖組p53表達(dá)隨藥物濃度增高著色明顯，模型組p53表達(dá)較低。綜上所述，山慈菇多糖具有一定的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制可能與相關(guān)蛋白表達(dá)一定的關(guān)聯(lián)。

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Study the Effect of Pleione yunnanensis Rolfe Polysaccharides on IL-2 and p53 Protein Expression

XU Xiao-juan1，2，ZHOU Zhi-han1，MAO Yu2，XU Fang2，LI Jie2，He Jian-hua3，*
（1.Hunan Medical and Pharmaceutical Technical College，Changsha 410128，Hunan，China；2.College of Food Scienceand Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；3.Collegeof Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China）

To study on the anti-tumor effct and mechanism of Pleione yunnanensis Rolfe polysaccharides（PYRP）onmicewith H22 hepatocellular carcinoma.The ascitic type and solid tumor ofH22 were established to observe the anti-tumor effect of sinapine.Used Elisa To analyze the level of IL-2，TNFαfrom peripheral blood.HE stainingwasused to observe the cellularmorphology.The thymus index and spleen indexwere used to analyze the influence of PYRP on the immune organs.Immunohistochemical（SABC）were used to study the apoptosismechanism induced by PYRP.The solid tumor inhibition ratio of low，middle，high and low dose of PYRP treated groupswere 21.58％，32.76％，40.05％respectively，PYRPon the life extension ofH22 ascites typemice is 21.4％.PYRP could promote the expression of IL-2 and promote the expression of p53.PYRP could inhibit the H22 solid tumor onmice significantly with dose-dependent and no obvious side effect.The probable route of inhibitory effectof PYRPonmicewith H22 solid tumor is immune-enhancementand acceleration of cellapoptosis.

Pleioneyunnanensis Rolfepolysaccharides；micewithH22hepatocellularcarcinoma；anti-tumor；IL-2；p53

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.002

中日政府間國(guó)際合作項(xiàng)目（2011DFA30490-2）

徐小娟（1987—），女（漢），助理講師，研究生/碩士，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與健康。

賀建華，男，教授，博士，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與健康。

2015-10-22