龍眼殼總黃酮的提取及其抗腫瘤的初步研究

宋佳玉，張清偉，劉金寶，郭秋蘭

（河南漯河醫學高等專科學校，河南漯河462002）

龍眼殼總黃酮的提取及其抗腫瘤的初步研究

宋佳玉，張清偉，劉金寶，郭秋蘭

（河南漯河醫學高等專科學校，河南漯河462002）

優化龍眼殼總黃酮提取工藝并對龍眼殼總黃酮體外抗腫瘤活性進行初步研究。采用乙醇回流提取方法提取龍眼殼總黃酮，在單因素分析的基礎上行正交試驗，結果表明：乙醇體積分數85％，加熱回流提取溫度70℃，料液比為1∶15（g/mL），加熱回流提取次數為3次時為最佳提取工藝，此時龍眼殼總黃酮提取物得率約為4.17％，該提取物中總黃酮含量約為64.77％。體外試驗表明龍眼殼總黃酮提取物可顯著抑制卵巢癌SKOV3細胞和宮頸癌Hela細胞的生長，并呈現一定的濃度和時間依賴性。

龍眼殼；總黃酮；提取；抗腫瘤活性

龍眼俗稱桂圓，又名木彈、驪珠、益智，其果肉為淡白色，肉質清甜。近年來一些學者認為龍眼肉能安神、補氣血、益心脾，可用于治療失眠、健忘、驚悸、怔忡、虛勞羸弱［1-3］。我國是龍眼的生產國，近些年來，總產量大幅度增長［4］。由于上市比較集中、貯運條件落后及儲藏保鮮技術不足，只有部分龍眼作為水果直接銷售，大量的龍眼用于加工龍眼糖水罐頭、龍眼肉、龍眼膏等；而剩余的龍眼殼因為對其功效成分知之甚少而未能開發利用，目前都是作為廢物直接丟棄。龍眼殼無毒、味甘、性溫，其散邪祛風、聰耳明目，可治心虛頭暈，研細治湯火傷亦佳［5］。最近研究表明龍眼殼提取物具有抗氧化、提高免疫力、抑制癌細胞增殖等活性［6-7］，已確定龍眼殼中含有核苷類、香豆素、多酚、萜類、糖類等［8-10］，而目前對龍眼殼中黃酮的提取研究報道較少。本研究從龍眼殼中提取了總黃酮，進一步優化了其提取工藝，并初步研究了其體外抗腫瘤活性，為龍眼殼進一步開發利用提供了參考。

1　材料、試劑與儀器

龍眼：采自福建泉州。

亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙醇、硝酸鋁均為國產分析純；蘆丁標準品（純度98％）：中國藥品生物制品檢定所；5-Fu注射液：上海旭東海普藥液有限公司。

ALPHA1-2LD plus冷凍干燥儀：德國MARTIN CHRIST公司；RE-3000A旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器公司；AL104電子天平：上海昕儀儀器儀表有限公司；101-2B電熱鼓風干燥箱：上海市實驗儀器總廠；WFJ-中草藥粉碎機：江陰市輝煌機械制造有限公司；HH-1恒溫水浴鍋：陜西太康生物科技有限公司；AEB-220電子天平：日本島津公司。

2　方法

2.1龍眼殼總黃酮提取工藝流程

龍眼殼粉末→浸泡→加熱回流提取→提取液→濃縮→冷凍干燥→龍眼殼總黃酮提取物

2.2龍眼殼總黃酮提取物得率的單因素試驗

分別研究料液比（原料質量：溶劑體積）、乙醇體積分數、加熱回流提取溫度、回流提取次數對龍眼殼總黃酮提取物得率的影響。

龍眼殼總黃酮提取物得率/％=m/（10×W）

式中：m為冷凍干燥得到的龍眼殼總黃酮的質量，mg；W為龍眼殼粉末的質量，g。

2.3龍眼殼提取物中總黃酮含量的測定

采用聚酰胺吸附-硝酸鋁顯色法，按照參考文獻［11-12］，制作蘆丁標準品標準曲線，得線性回歸方程A= 1.842 9C－0.000 4，A為510 nm處吸光度值，C為質量濃度（mg/mL），線性范圍為0～0.5mg，相關系數R2為0.999 9。

2.4龍眼殼總黃酮提取物體外抗腫瘤試驗

按照參考文獻［13-14］測定龍眼殼總黃酮提取物對卵巢癌SKOV3細胞和宮頸癌Hela細胞的增殖抑制作用。調整卵巢癌SKOV3細胞和宮頸癌Hela細胞濃度為2×103/mL分別接種于96孔板中，每孔100μL。試驗分為陰性對照組、提取物組、5-Fu組，每組設5個復孔并設空白調零孔。24 h后，陰性對照組加200μL培養液，提取物組分別加入200μL終濃度為0.1、0.3、0.6、0.9、1.2mg/mL總黃酮提取物，5-Fu組加200μL終濃度為0.38mg/mL 5-Fu，分別培養24、48、72 h后，加入MTT溶液20μL，培養4 h后加入150μL二甲基亞砜，用酶聯檢測儀在490 nm處測定各孔的光密度值（OD）。計算細胞增殖抑制率（IR）。試驗重復3次。

2.5統計學處理

3　結果與分析

3.1影響龍眼殼總黃酮提取物得率的單因素試驗

3.1.1乙醇體積分數對龍眼殼總黃酮提取物得率的影響

在料液比1∶5（g/mL）、提取溫度50℃、回流提取3次條件下，研究乙醇體積分數對龍眼殼總黃酮提取物得率的影響，見圖1。

由圖1可知：提取物得率隨著乙醇體積分數的增大而升高，當乙醇體積分數為85％時總黃酮得率最大，而當再增加乙醇體積分數時，其得率反而降低。造成這種現象的原因可能是由于乙醇體積分數不同其極性也不同，85％乙醇的極性和龍眼殼總黃酮的極性相似，根據相似相容原理乙醇分數為85％時，總黃酮得率最大，故在正交試驗設計中乙醇體積分數設置為75％、85％、95％。

圖1　乙醇體積分數對總黃酮提取物得率的影響Fig.1 Effectsof different volum e fraction of ethanolon theyield of flavonoids

3.1.2加熱回流提取溫度對龍眼殼總黃酮提取物得率的影響

在乙醇體積分數85％、料液比1∶5（g/mL）、回流提取3次條件下，研究加熱回流提取溫度對龍眼殼總黃酮提取物得率的影響，見圖2。

圖2　加熱回流提取溫度對總黃酮提取物得率的影響Fig.2 Effectsof extraction temperatureon the yield of flavonoids

由圖2可知：提取物得率隨著溫度的升高而增加，當加熱回流提取溫度為70℃時得率最多，而當再增加溫度時，其得率反而降低。可能是因為隨著溫度的升高，總黃酮向溶液溶出量增加，當溫度達到70℃時，得率最大，當溫度大于70℃時，得率反而下降，可能是由于溫度較高時蛋白質變性，影響了細胞的破裂，阻礙了總黃酮的溶出，從而降低了總黃酮提取物的得率。故在正交試驗設計中溫度為50、60、70℃。

3.1.3加熱回流提取次數對龍眼殼總黃酮提取物得率的影響

在乙醇體積分數85％、料液比1∶5（g/mL）、回流提取溫度為50℃條件下，研究加熱回流提取次數對龍眼殼總黃酮提取物得率的影響，見圖3。

由圖3可知：總黃酮提取物得率隨著提取次數的增加而增加，當提取次數等于3次時，提取量趨于穩定，說明當提取次數為3次時，總黃酮已被充分提取。故從效率出發，在正交試驗設計中提取次數設為1、2、3次。

3.1.4料液比對龍眼殼總黃酮提取物得率的影響

在乙醇體積分數85％、提取溫度50℃、回流提取3次條件下，研究料液比對龍眼殼總黃酮提取物得率的影響，見圖4。

圖3　加熱回流提取次數對總黃酮提取物得率的影響Fig.3 Effectsof extraction timeson the yield of flavonoids

圖4　料液比對總黃酮提取物得率的影響Fig.4 Effectsof the ratio ofmaterialand liquid on the yield of flavonoids

由圖4可知：隨料液比的增加，龍眼殼總黃酮提取物得率逐漸升高，但當料液比大于1∶15（g/mL）時，提取量趨于平穩。說明隨著料液比增加，總黃酮溶出量逐漸增大，當其充分溶出后，即使加大料液比，總黃酮提取物得率變化不明顯。基于成本考慮，正交試驗設計中料液比設置為1∶5、1∶10、1∶15（g/mL）。

3.2正交試驗優化龍眼殼總黃酮提取工藝

在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇體積分數、加熱回流提取溫度、加熱回流提取次數、料液比作為考察因素，進行L9（34）正交試驗，試驗因素和水平見表1，結果與分析見表2。

由表2可知，影響龍眼殼總黃酮提取物得率的影響因素順序為：乙醇體積分數（A）＞加熱回流提取溫度（B）＞料液比（D）＞加熱回流提取次數（C），龍眼殼總黃酮提取的最佳工藝條件為：A2B3C3D3，即乙醇體積分數85％，加熱回流提取溫度70℃，料液比為1∶15（g/mL），加熱回流提取次數為3次。

表1　正交試驗因素水平設置表Table1 Factorsand levelsof orthogonalexperiment

表2　L9（34）正交試驗結果Table2 Resultsof L9（34）orthogonalexperim ent

3.3龍眼殼提取物中總黃酮含量

根據最佳提取條件進行平行試驗3次，龍眼殼總黃酮提取物得率為4.17％。按照聚酰胺吸附-硝酸鋁顯色法檢測龍眼殼提取物中總黃酮含量約為64.77％。

3.4龍眼殼總黃酮提取物對卵巢癌SKOV3細胞和宮頸癌Hela細胞的增殖抑制作用

龍眼殼總黃酮提取物對卵巢癌SKOV3細胞和宮頸癌Hela細胞的增殖抑制作用，見表3、表4。

表3　龍眼殼總黃酮提取物對卵巢癌SKOV3細胞的增殖抑制作用（±s，n=5）Tab le3 Inhibitory effectof longan shell flavonoidson SKOV3（±s，n=5）

表3　龍眼殼總黃酮提取物對卵巢癌SKOV3細胞的增殖抑制作用（±s，n=5）Tab le3 Inhibitory effectof longan shell flavonoidson SKOV3（±s，n=5）

分組濃度/（mg/mL）24 h 48 h 72 h ％OD IR/％OD IR/％OD IR/％陰性對照-0.33±0.023-0.47±0.019-0.65±0.029-5-Fu 0.38 0.17±0.00*44.48 0.18±0.011*61.70 0.05±0.012*92.22提取物0.10 0.37±0.014-0.40±0.014 14.89 0.49±0.016*24.62

續表3龍眼殼總黃酮提取物對卵巢癌SKOV3細胞的增殖抑制作用（±s，n=5）Continue table3 Inhibitory effectof longan shell flavonoidson SKOV3（±s，n=5）

續表3龍眼殼總黃酮提取物對卵巢癌SKOV3細胞的增殖抑制作用（±s，n=5）Continue table3 Inhibitory effectof longan shell flavonoidson SKOV3（±s，n=5）

注：*表示與陰性對照組比較，P＜0.05；-表示對腫瘤細胞無抑制作用。

分組濃度/（mg/mL）24 h 48 h 72 h ％OD IR/％OD IR/％OD IR/％陰性對照0.30 0.34±0.019-0.37±0.020 21.27 0.45±0.017*30.77 5-Fu 0.60 0.32±0.015 3.03 0.35±0.013 25.53 0.35±0.015*46.15提取物0.90 0.30±0.020 9.09 0.30±0.011*36.17 0.28±0.016*56.92 1.20 0.28±0.023 15.15 0.24±0.020*48.94 0.21±0.019*67.69

表4　龍眼殼總黃酮提取物對宮頸癌Hela細胞的增殖抑制作用（±s，n=5）Table4 Inhibitory effectof longan shell flavonoidson Hela（±s，n=5）

表4　龍眼殼總黃酮提取物對宮頸癌Hela細胞的增殖抑制作用（±s，n=5）Table4 Inhibitory effectof longan shell flavonoidson Hela（±s，n=5）

注：*表示與陰性對照組比較，P＜0.05；-表示對腫瘤細胞無抑制作用。

分組濃度/（mg/mL）24 h 48 h 72 h ％OD IR/％OD IR/％OD IR/％陰性對照-0.33±0.023-0.47±0.019-0.65±0.029-5-Fu 0.38 0.17±0.00*44.48 0.18±0.011*61.70 0.05±0.012*92.22提取物0.10 0.27±0.015-0.40±0.019 14.89 0.47±0.020*27.69 0.30 0.20±0.020-0.35±0.022*25.53 0.42±0.015*35.38 0.60 0.18±0.017-0.31±0.012*30.04 0.35±0.021*46.15 0.90 0.30±0.025 9.09 0.28±0.014*40.42 0.29±0.018*55.38 1.20 0.27±0.030 18.18 0.23±0.023*51.06 0.18±0.019*72.30

藥物作用24、48、72 h后，MTT試驗結果顯示龍眼殼總黃酮提取物對卵巢癌SKOV3細胞和宮頸癌Hela細胞有增殖抑制作用，且呈一定的濃度和時間依賴性。

4　討論

本試驗通過對乙醇體積分數（A）、加熱回流提取溫度（B）、加熱回流提取次數（C）、料液比（D）進行單因素試驗和正交試驗，最終確定龍眼殼總黃酮最佳提取工藝為A2B3C3D3即乙醇體積分數85％，加熱回流提取溫度70℃，料液比為1∶15（g/mL），加熱回流提取次數為3次。按此最優組合平行試驗3次，龍眼殼總黃酮提取物平均得率為4.17％。按照聚酰胺吸附-硝酸鋁顯色法檢測該龍眼殼提取物中總黃酮含量約為64.77％。

體外抗腫瘤結果表明，龍眼殼總黃酮提取物可明顯抑制卵巢癌SKOV3細胞和宮頸癌Hela細胞的增殖且呈現出一定濃度和時間依賴性，當總黃酮提取物的濃度為1.2mg/mL，作用時間為72 h時抑瘤率分別為67.69、72.30％，可見沒有純化的龍眼殼總黃酮提取物具有良好的抗腫瘤活性，龍眼殼作為天然的抗腫瘤藥物具有很好的開發潛力。

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The Extraction of Longan Shell Flavonoids and Prelim inary Study on its Anti-tumor Activity

SONG Jia-yu，ZHANG Qing-wei，LIU Jin-bao，GUO Qiu-lan
（Luohe Medical College，Luohe 462002，Henan，China）

Extraction process condition was optimized and the antitumor activity in vitro of Longan shell flavonoidswas studied.On the basis of single factor experiments，orthogonal testwas used.The optimal conditions of extraction were obtained as follows：alcohol volume fraction 85％，3 times of extraction，extraction temperature 70℃，the ratioofmaterialand liquid 1∶15（g/mL）.Theyield of longan shell flavonoidsextractswas about4.17％，the total contentof flavonoids in the extractswasabout64.77％.In vitro，the resultsshowed that longan shell flavonoids significantly inhibited the growth of SKOV3 and Hela cells，and showed a certain concentration and time dependence.

longanshell；flavonoids；extraction；antitumoractivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.012

宋佳玉（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：腫瘤藥理。

2015-11-11