利用JMP軟件優化威蘭膠發酵培養基

梁锏文，李智斌，陳柏銓

（廣東中科天元新能源科技有限公司，廣東廣州510640）

利用JMP軟件優化威蘭膠發酵培養基

梁锏文，李智斌，陳柏銓

（廣東中科天元新能源科技有限公司，廣東廣州510640）

利用統計分析軟件JMP的試驗設計（DOE）功能（包括Plackett-Burman設計、析因設計、中心組合設計，預測刻畫等）對威蘭膠發酵菌株Alcaligenessp.Y5的發酵培養基進行了優化，得到一組最佳發酵培養基配方：葡萄糖52.9 g/L、牛肉膏4.0 g/L、K2HPO4·7H2O 2.2g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO32.0 g/L，吐溫80 0.5 g/L。優化后威蘭膠產量由初始的15.72 g/L提高到26.58g/L，提高了69.08％。

JMP；威蘭膠；優化；Plackett-Burman設計；析因設計；預測刻畫

威蘭膠（welan gum）是由某些產堿桿菌Alcaligenes sp.以及鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.合成的微生物雜多糖［1］，是美國斯比凱可公司（CPKelco）20世紀80年代繼黃原膠、結冷膠之后開發的第3代微生物胞外多糖之一，其分子量高達數百萬。它的結構骨架由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖重復單元構成，側鏈由單一的L-甘露糖或L-鼠李糖構成［2］，結構見圖1。

圖1　威蘭膠結構式Fig.1 Thestructureofwelan gum

威蘭膠水溶液具有假塑性流體特征，其低濃度水溶液具有很高的粘度，并具有良好的穩定性，溫度升高至150℃時，其黏度基本不變，其耐溫極限值比黃原膠高20℃～30℃。威蘭膠水溶液對酸、堿穩定，其黏度在pH2～13范圍內基本不受影響［3-4］；威蘭膠溶液具有獨特的剪切稀釋性能，這一點在石油鉆井中發揮突出的作用［5］。威蘭膠溶液的獨特性質超越其它多糖，可作為增稠劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑、潤滑劑、成膜劑和粘合劑應用于石油、混凝土、食品、油墨等工業［1，6-8］。目前僅美國Kelco公司商業化生產威蘭膠，國內尚處于實驗室研究的起步階段。

培養基優化的方法很多，除單因素試驗優化外，還包括正交設計，均勻設計，響應面優化等方法［9］，許多試驗設計優化和分析都可借助一些商業軟件如Design Expert、DPS、SAS、SPSS、Minitab、JMP等來完成。其中JMP是SAS推出的一種交互式可視化統計發現軟件，作為一款優秀的圖形化統計分析軟件，其試驗設計（DOE）內容豐富（包括定制設計、篩選設計、響應面設計、非線性設計、空間填充設計、混料設計、加速壽命設計、擴充設計等），試驗設置非常靈活，試驗分析功能強大（模型擬合、圖形展示、數據挖掘、模擬器等），利用JMP的試驗設計可大大提高試驗效率。本文以分離篩選的威蘭膠發酵菌株為對象，利用JMP軟件試驗設計（DOE）功能對其發酵培養基進行設計優化，得到最佳培養基配方，并應用于發酵罐發酵試驗，驗證實際效果，為進一步擴大試驗提供參考。

1　材料與方法

1.1菌株與培養基

菌株（產堿桿菌Alcaligenessp.Y5）：廣東省生物液體燃料（中科天元）工程技術研究中心實驗室保藏。

斜面培養基（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.0±0.2。

種子培養基（g/L）：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母粉5，K2HPO4·7H2O 2，MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.0±0.2。

初始發酵培養基（g/L）：葡萄糖40，蛋白胨4，K2HPO4·7H2O 2，MgSO4·7H2O 0.1，CaCO33.0，FeSO4·7H2O 0.01，吐溫80 0.5，pH 7.0±0.2。

1.2方法

1.2.1培養方法

1.2.1.1種子培養

250mL三角瓶裝種子培養基50mL，接種活化好的菌種斜面1環～2環，30℃，搖床轉速200 r/min培養18 h～20 h。

1.2.1.2發酵培養

250mL三角瓶裝發酵培養基50mL，按5％（體積分數）的接種量接種培養好的種子液到發酵培養基中，30℃，搖床轉速250 r/min培養72 h。

1.2.2試驗分析方法

1.2.2.1威蘭膠產量測定

發酵液經80℃水浴滅活20min，冷卻后加入2倍體積的95％乙醇，劇烈震蕩至出現絮狀沉淀，4℃靜置過夜，8 000 r/min離心20min，棄去上清液，再用95％乙醇洗滌沉淀2次，將沉淀物于60℃烘干至恒重，電子天平稱重。

1.2.2.2黏度的測定

用SNB-1數字粘度計（上海精天），4號轉子，30 r/min，室溫測定發酵液黏度。

1.2.3試驗優化步驟及軟件

首先采用Plackett-Burman試驗設計從眾多發酵培養基組分中篩選出影響威蘭膠產量的重要影響因子；再通過析因設計對篩選的重要因子進行初步優化，確定最佳范圍；最后利用中心組合設計進行高級優化，并利用JMP的刻畫器預測出最佳培養基組分及產量，最后對該培養基組分進行驗證。

試驗設計及分析軟件為JMP 9.0試用版。

2　結果與討論

2.1Plackett-Burman設計

Plackett-Burman設計是一種兩水平的試驗優化方法，可以用最少的試驗次數達到使因子的主效果得到盡可能精確的估計，適用于從眾多的考察因子中快速有效地篩選出最為重要的幾個因子。本文從初始發酵培養基組分出發，各組分及水平設置見表1。利用JMP試驗設計中的篩選設計，響應Y值為威蘭膠產量，添加8個連續因子，設計類型為Plackett-Burman，添加3個中心點，試驗共15組，所得設計表及結果見表2。

表1　Plackett-Burm an設計中培養基組分及水平設置Table1 M edia componentsand test levels for Plackett-Burm an experim ent

表2　Plackett-Burman試驗及結果Table2 Plackett-Burman experimentand results

Plackett-Burman試驗參數估計見表3。

表3　Plackett-Burman參數估計Table3 Param etersestimatesof Plackett-Burm an experiment

從表3中可以看出，R2=0.990 9，調整R2=0.978 9，失擬P=0.653 7＞0.05，一階模型擬合良好。重要影響因子且為正效應的有葡萄糖，牛肉膏，蛋白胨和K2HPO4·7H2O（P＜0.05），其中牛肉膏和蛋白胨均為氮源，考慮到成本因素，后續試驗采用牛肉膏作為氮源；培養基組分中FeSO4·7H2O為重要影響因子（P＜0.05）且為負效應，其低水平為0，故從培養基中剔除；其它因子影響不大，都取低水平進行下一步試驗。

2.2析因設計

從2.1的Plackett-Burman試驗可知發酵培養基組分中葡萄糖、牛肉膏、K2HPO4·7H2O為正效應，提高各組分用量可以提高威蘭膠產量，由于試驗因素較少，可采用JMP給定的完全析因設計方案，添加3個中心點，試驗共11組，試驗設計及結果見表4。

表4　析因試驗設計及結果Tab le4 Factorialexperim entand results

根據表4試驗結果，進行一階模型擬合，結果見表5。

表5　析因設計一階模型參數估計Table5 Param etersestimatesof first-orderm odel from factorial experim ent

由表5可知，R2=0.566 4，調整R2=-0.445 2，失擬P=0.009 9＜0.05，說明一階模型擬合較差，存在彎曲效應。

重新對表4結果運行篩選腳本（分析-建模-篩選），結果見表6。

表6　析因設計因子篩選結果Table6 Factor screening results from factorialexperiment

從表6中可以看出，影響顯著的因子有葡萄糖X1，K2HPO4·7H2O X4和葡萄糖的二次效應X12，其它因子影響不顯著（其中牛肉膏為負效應，后續試驗保持低水平）。利用這3個重要因子重新構建模型，結果見表7。

表7　析因設計二階模型參數估計Tab le7 Param etersestimatesof second-orderm odel from factorialexperiment

由表7可知，R2=0.987 7，調整R2=0.982 4，失擬P= 0.356 6＞0.05，說明二階模型擬合良好，二階方程為Y= 25.20+3.43X1-0.51X4-5.78X12。

利用JMP的刻畫器功能，以最大化期望（威蘭膠產量最大化）進行預測，如圖2所示。

圖2　析因設計威蘭膠產量預測Fig.2 Forecastofwelan gum production from factorialexperiment

由圖2所示，當培養基中葡萄糖為53.0 g/L，K2HPO4·7H2O為2.0 g/L，預計威蘭膠產量達到最高，為（26.22±0.83）g/L（期望值為0.857 9）。

2.3中心組合設計

通過析因試驗的初步優化結果可知葡萄糖和K2HPO4·7H2O為重要影響因子，且濃度分別為53.0g/L、2.0 g/L時，預計威蘭膠產量達到最高，故在此基礎上進行中心組合設計，設計表及結果見表8。

表8　中心組合設計及結果Table8 Central compositon design and results

中心組合設計參數估計和方差分析見表9和表10。

由表9、表10可知，R2=0.973 1，調整R2=0.939 4，失擬P=0.169 5＞0.05，說明模型擬合良好，二階方程為Y=26.56+0.01X1+1.13X4-0.16X1X4-1.55X12-1.17X42。

表9　中心組合設計參數估計Tab le9 Parametersestimatesof centralcom positon design

表10　中心組合設計方差分析Table10 Analysisof varianceof centralcom positon design

再次利用JMP刻畫器進行預測，如圖3和圖4。

圖3　中心組合設計威蘭膠產量預測Fig.3 Forecastofwelan gum production from centralcom positon design

圖4　響應面圖Fig.4 Responsesurfacesp lot

由圖2和圖3可知，當培養基中葡萄糖為52.9g/L，K2HPO4·7H2O為2.2 g/L，預計威蘭膠產量為（26.83± 0.72）g/L（期望值為0.949 1），另外，從圖2可以看出，當葡萄糖含量超過52.89 g/L時，產量不再提高，而呈下降趨勢，這可能有二方面原因，一是過高的葡萄糖濃度抑制了威蘭膠的合成，二是威蘭膠發酵過程中黏度升高，影響了培養基中氧的傳遞，氧成為威蘭膠發酵的限制因子［10］，導致產量不再增高。

通過上述優化步驟，最終得出的威蘭膠發酵配方為（g/L）：葡萄糖52.9，牛肉膏4.0，K2HPO4·7H2O 2.2，MgSO4·7H2O 0.1，CaCO32.0，吐溫80 0.5。經過3次平行驗證試驗威蘭膠產量為（26.58±0.16）g/L，與預測值進行均值比較P=0.593 1＞0.05，無顯著性差異，證明了與JMP預測結果相符。

3　結論

通過單因素試驗，Plackett-Burman設計，析因設計，中心組合設計以及利用JMP軟件的預測刻畫功能，得到最佳威蘭膠發酵培養基配方為葡萄糖52.9 g/L、牛肉膏4.0 g/L、K2HPO4·7H2O 2.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCO32.0 g/L，吐溫80 0.5 g/L。優化后威蘭膠產量由初始的15.72 g/L提高到26.58 g/L，提高了69.08％。

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Optim ization of Fermentation Media for Welan Gum Using JMP

LIANG Jian-wen，LI Zhi-bin，CHEN Bai-quan
（Guangdong Zhongke Tianyuan New Energy Scienceand Technology Co.，Ltd.，Guangzhou 510640，Guangdong，China）

The statistical analysis soft ware JMP（its function include sPlackett-Burman design，Factorialdesign，Central compositon design，Prediction Profiler etal.）wasapplied to optimize the fermentationmedium ofwelan gum by Alcaligenes sp.Y5.The optimal composition of themedium was determined as glucose 52.9 g/L，beef extract4.0g/L，K2HPO4·7H2O 2.2g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO32.0g/L，Tween800.5g/Lbyusing theoptimised medium，thewelan gum production increased from 15.72 g/L to26.58 g/L，with an increaseof69.08％.

JMP；welangum；optimization；Plackett-Burmandesign；Factorialdesign；Predictionprofiler

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.024

梁锏文（1980—），男（漢），碩士，研究方向：工業微生物。

2015-11-04