沙丁胺醇免疫層析試紙條的應用研究

劉冰，王玲玲，童貝，馮久慧，生威，張燕，王碩

（食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

沙丁胺醇免疫層析試紙條的應用研究

劉冰，王玲玲，童貝，馮久慧，生威，張燕，王碩*

（食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

用膠體金和納米金-聚苯胺-納米金微球（GPG）分別標記制備的沙丁胺醇多克隆抗體，噴涂在玻璃纖維墊上，將包被抗原和羊抗兔二抗分別固定到硝酸纖維素膜上作為檢測線（T-Line）和質控線（C-Line），干燥后組裝試紙條，建立免疫層析分析方法。考查檢測試紙條的靈敏度和穩定性，并應用于動物源性食品（豬肉、牛肉、羊肉和豬肝）中沙丁胺醇殘留的可視化檢測。實驗結果可以看出，沙丁胺醇膠體金標記免疫層析分析方法的樣品檢出限為5μg/L，沙丁胺醇GPG標記免疫層析分析方法的樣品檢出限為10μg/L。

沙丁胺醇；膠體金；納米金-聚苯胺-納米金微球；免疫層析試紙條

沙丁胺醇（Salbutamol，SAL），又名咳喘寧、舒喘寧、索布胺等，是β-腎上腺素受體激動劑的一種，臨床上最初被用于治療和預防呼吸系統疾病和支氣管哮喘［1-2］。將沙丁胺醇作為生長促進劑飼喂動物，會導致部分藥物殘留在動物體內。沙丁胺醇對于患有心腦血管疾病的人危害較大，對于糖尿病患者，容易導致乳酸中毒。研究表明，沙丁胺醇會損害母豬的生殖系統［3-4］。我國禁止將沙丁胺醇及其鹽、酯應用于所有食用動物中［5］。歐盟（European Union）禁止沙丁胺醇等β-興奮劑的所有用途［6］。

目前關于動物組織中沙丁胺醇的檢測方法比較多，膠體金免疫層析技術在沙丁胺醇殘留快速檢測方面得到了廣泛應用［7-9］。曾紅惠等［7］建立了HPLC法同時檢測肉制品中的沙丁胺醇、克倫特羅和萊克多巴胺。Degroodt JM等［8］建立了免疫親和層析（IAC）-高效液相色譜法檢測肝臟中的沙丁胺醇殘留。試驗采用0.01mol/L的鹽酸提取樣品，經IAC法對提取液進行凈化。得到SAL的定量限為1μg/kg，建立的標注曲線在0.2 ng/mL～10 ng/mL范圍內線性良好，回收率為67％～80％。Ventura R等［9］建立了超高效液相色譜/串聯質譜法對尿液中的沙丁胺醇進行直接定量檢測。吳巧麗等［10］采用GICA方法檢測動物組織和飼料中的沙丁胺醇殘留。采用金增強技術，金顆粒聚集的越多，檢測信號就越強。在酸性介質中，采用氯金酸水溶液氧化苯胺，使苯胺單體發生氧化聚合，氯金酸被還原成膠體金，包埋在聚苯胺中，形成納米金-聚苯胺復合物。再向聚合物中添加粒徑為20 nm左右的膠體金溶液，通過物理吸附形成納米金-聚苯胺-納米金微球（GPG）。該材料被Cui YL等［11］應用于電化學免疫傳感器中檢測促甲狀腺激素。材料具有良好的電化學性能和較大的表面積，能結合更多的HRP標記二抗，從而提高信號強度。對促甲狀腺激素的檢出限為0.005μIU/mL。試驗以沙丁胺醇作為目標物，比較膠體金和GPG標記材料所建立的免疫層析分析方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

沙丁胺醇抗血清：天津科技大學食品營養與安全重點實驗室自制；沙丁胺醇（SAL）瑪雅試劑；羊抗兔二抗、氯金酸、檸檬酸三鈉、牛血清白蛋白（OVA）、鹽酸克倫特羅（CL）、異丙腎上腺素（ISOP）、萊克多巴胺（RAC）、特布他林（TER）均購自美國Sigma公司；硝酸纖維素膜（135NC膜）購自美國Millipore公司；樣品墊、結合墊、吸水紙以及PVC底板均購自上海金標科技有限公司；豬肉、牛肉、羊肉、豬肝均購自天津某超市。

蛋白純化儀：美國BIO-RAD公司；紫外分光光度計：美國Varian公司；透射電子顯微鏡：日本電子光學公司；真空干燥箱：天津三水儀器有限公司；雙維往復劃膜儀、全自動斬切機：上海金標生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1沙丁胺醇包被抗原的制備

1.2.1.1沙丁胺醇半抗原的制備

準確稱取沙丁胺醇200mg（0.836mmol），置于100mL圓底燒瓶中，加入12mL無水乙醇（使用前經過脫水處理）超聲處理使其完全溶解。稱取200mg（2.00mmol）丁二酸酐，在磁力攪拌條件下加入到上述溶液中，室溫反應3 h～4 h，反應結束后，將反應液旋干，將附著于燒杯內壁上的固體刮下，用無水乙醇洗滌3次，過濾收集固體，真空干燥除去溶劑，盛裝于棕色瓶中，4℃冰箱保存備用［12］。

1.2.1.2沙丁胺醇包被抗原的制備

采用碳二亞胺法（EDC法）制備包被原。準確稱取沙丁胺醇丁二酸衍生物5mg（0.015mmol），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（0.022mmol）4.2mg，用0.5mL 130mmol/L碳酸氫鈉緩沖液溶解，室溫下攪拌活化30min，此反應液命名為A液。準確稱取10mg卵清蛋白（OVA），用2mL碳酸氫鈉緩沖液（130mmol/L）溶解，在緩慢攪拌條件下，吸取A液300μL加入到蛋白溶液中（每2min加5μL，冰浴降溫），置于4℃冰箱中攪拌過夜。將反應所得的偶聯物裝入透析袋中，4℃條件下用磷酸緩沖液（PB）透析3 d，取出分裝，每1mL加入5μL 10％疊氮鈉，4℃冰箱保存備用。

1.2.2沙丁胺醇多克隆抗體的純化

采用ProteinA-sephoarse 4B親合層析柱對沙丁胺醇抗血清進行純化處理，在4℃條件下采用PB緩沖液透析3 d，可以得到接近分析純的抗體。

1.2.3標記材料的制備

1.2.3.1膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。向制備膠體金的錐形瓶中加入足量的雙蒸水，于恒溫加熱磁力攪拌器上加熱至沸騰，約1min后，倒掉沸水。量取100mL雙蒸水倒入錐形瓶，用記號筆標記水位，去除1mL水，加入1mL 1％的氯金酸溶液，混勻后加熱至沸騰。在攪拌條件下迅速向溶液中加入2.25mL 1％的檸檬酸三鈉溶液。計時約2min內，溶液顏色發生變化，最終呈現穩定的酒紅色。繼續煮沸15min，冷卻至室溫，加入雙蒸水定容至100mL，轉移到藍蓋瓶中，于4℃避光保存［15］。觀察所制備的膠體金溶液的顏色、透明度、分散狀態、有無沉淀等，以初步判定膠體金的質量。利用透射電鏡對膠體金顆粒的超微結構進行掃描，觀察膠體金的粒徑大小、粒徑分布是否均勻等［13-14］。

1.2.3.2GPG的制備及質量鑒定

配制含有0.01mol/L和0.1mol/L苯胺的鹽酸溶液。比較苯胺的含量對反應的影響。分別取10mL含0.01mol/L和0.1mol/L苯胺的HCl溶液于25mL圓底燒瓶中，在磁力攪拌條件下加入3mL，1mmol/LHAuCl4水溶液，室溫條件下反應40min（充入N2保護，避光反應）。將反應液離心，收集沉淀（15 000 r/min，30min），加入3mL水復溶，沉淀洗滌3次。最終將沉淀重懸于1mL水中。將溶液移至小玻璃瓶內，逐滴加入3mL膠體金溶液，室溫下輕輕振搖過夜（沖入N2保護，避光反應）。離心收集GPG（15000 r/min，30min），用1mL水重懸，于4℃冰箱內保存備用。直接觀察所制備的納米金-聚苯胺-納米金微球（GPG）的顏色、透明度和分散狀態，以初步判定GPG的質量。利用透射電子顯微鏡對GPG顆粒的結構進行掃描，觀察顆粒的粒徑大小以及分布狀態等［15］。

1.2.4標記抗體方法的確定

1.2.4.1膠體金標記抗體

取1mL膠體金于離心管中，用K2CO3調節pH值為9，加入20μL抗體，混勻后，于4℃靜置1 h。每管加入20μL20％的BSA溶液和10μL20％的PEG-20000溶液，室溫靜置20min。將靜置后的溶液于4℃，2000 r/min條件下離心15min，保留上清液，除去標記過程中形成的聚合物。接下來將上清液于4℃，10 000 r/min條件下離心30min，保留沉淀，未標記的抗體及金粒子存在于上清中。將沉淀用金標工作液稀釋適當倍數，4℃冰箱保存［16］。

1.2.4.2GPG標記抗體

取1mLGPG溶液，冰浴超聲5min，用0.2mol/L的K2CO3溶液調節pH為8，混勻后加入20μLSAL抗體，快速混勻，置于4℃冰箱內靜置過夜（14 h～16 h）。每毫升加入20μL 20％的BSA溶液和10μL 20％的PEG-20000溶液，混勻后室溫靜置20min。在11 063 r/min，4℃條件下離心20min，保留沉淀，棄去上清。沉淀用金標抗體稀釋液稀釋。

用標品稀釋液配制一系列濃度的沙丁胺醇標準品溶液：1、2、5、10μg/L，取100μL標準品溶液用于試紙條上樣，觀察試紙條顯色情況，以檢測線顏色與空白對照檢測線顏色有明顯差別時的最低標準品濃度作為試紙條檢出限。

1.2.6試紙條特異性的確定

本試驗選取與沙丁胺醇結構類似的五種β-興奮劑類獸藥：鹽酸克倫特羅（CLB）、異丙腎上腺素（ISOP）、特布他林（TER）、萊克多巴胺（RAC）和多巴酚丁胺（DOB），用建立的膠體金標記免疫層析試紙條方法進行檢測，以確定所建立的試紙條檢測方法的特異性。

1.2.7試紙條實際樣品的檢測

1.2.7.1樣品基質處理方法

本實驗選取市售的豬肉、牛肉、羊肉和豬肝作為實際樣品，具體基質處理方法如下：取1 g均質后的樣品于50mL離心管中，加入1mL 0.1mol/L的鹽酸溶液，超聲15min，再加入4mLPBS緩沖液，高速混旋3min，于6 137 r/min，10℃條件下離心10min，吸取上清液，用1mol/L氫氧化鈉溶液將pH值調至中性（若有沉淀，在6 861 r/min，10℃條件下離心10min），取上清液直接用于試紙條檢測。

1.2.7.2樣品添加回收試驗

661 Prevalence of skin diseases among marine-training soldiers stationed in east coastal area and its influencing factors

樣品豬肉、牛肉、羊肉、豬肝經試劑盒驗證沙丁胺醇含量低于試劑盒檢出限，作為空白基質進行添加回收實驗。豬肉、牛肉、羊肉、豬肝4種陰性樣品中分別添加0、5、10、50μg/kg的沙丁胺醇標準品，按照上述基質處理方法處理后進行實驗，觀察回收結果。

2　結果與討論

2.1標記材料的質量鑒定

制備出的膠體金溶液為酒紅色，肉眼可見溶液澄清透明，狀態穩定，表面無懸浮雜質，溶液底部無聚沉顆粒，初步說明制備的膠體金質量良好。利用透射電子顯微鏡對膠體金顆粒的超微結構進行掃描，結果見圖1。

圖1　標記材料的透射電鏡掃描圖Fig.1 Transm ission electronm icroscopy（TEM）of labelled materials

從圖中可以看出，膠體金粒徑平均粒徑在18 nm左右，與理論值相符。膠體金顆粒呈現球形，粒徑均一。目視該GPG材料為黑色溶液，狀態較為均一，靜置一周后出現沉淀，但是搖勻后仍呈現均一狀態，不影響使用。從其透射電鏡掃描圖可見膠體金顆粒吸附在聚苯胺表面。

2.2試紙條檢出限的確定

配制一系列濃度的沙丁胺醇標準品溶液，采用優化出的最佳條件組裝試紙條，隨著標準品濃度的升高，試紙條檢測線顏色逐漸變淺直至消線。標準品濃度依次是0、1、2、5、10μg/L，膠體金標記抗體的試紙條結果如圖2所示。

圖2　沙丁胺醇膠體金試紙條檢出限的確定Fig.2 The detection lim itof colloidalgold strips for SAL

當標準品中沙丁胺醇的濃度為2μg/L時，膠體金試紙條檢測線明顯比陰性對照淺，當標準品中沙丁胺醇的濃度達到10μg/L時，試紙條檢測線消失。經過多次重復實驗，定義采用鋪墊組裝方式建立的膠體金標記免疫層析試紙條的目視檢出限為2μg/L。標準品濃度依次是0、2、5、10、20μg/L，膠體金及GPG標記抗體的試紙條結果如圖3所示。

圖3　沙丁胺醇GPG試紙條檢出限的確定Fig.3 The detection lim itof GPG strips for SAL

當沙丁胺醇標準品濃度為5μg/L時，GPG試紙條檢測線與空白對照檢測線顏色有明顯差別，當沙丁胺醇標準品濃度為10μg/L時，試紙條檢測線消線。經過多次重復試驗，定義GPG標記免疫層析試紙條的目視檢出限為5μg/L。

2.3試紙條特異性的確定

選擇了5種與沙丁胺醇結構類似的β-興奮劑類獸藥（克倫特羅、特布他林、異丙腎上腺素、萊克多巴胺、多巴酚丁胺）進行交叉反應實驗。當克倫特羅的濃度為10μg/L時，試紙條檢測線消失，說明該抗體與克倫特羅交叉反應明顯，可同時用于克倫特羅的檢測。當特布他林的濃度為200μg/L時，試紙條檢測線消失，說明該抗體與特布他林存在交叉反應。對于其他三種β-興奮劑和八種常見獸藥，當其濃度達到1000μg/L時，試紙條的檢測線與質控線顏色依然一致，說明該抗體與其他3種β-興奮劑類獸藥和八種常見獸藥基本無交叉反應。

2.4試紙條實際樣品的檢測

向豬肉、牛肉、羊肉、豬肝4種陰性樣品中分別添加沙丁胺醇標準品，用HCl/PBST進行提取和稀釋即可消除基質影響。對于膠體金標記的試紙條，標準品添加濃度依次是0、5、10、50μg/L，4種樣品的試紙條結果如圖4所示。

圖4　4種樣品的添加回收試驗結果Fig.4 The recovery experiments resultof four spiked samples

樣品當添加濃度為5μg/L時，試紙條檢測線顏色與空白對照檢測線顏色有明顯差別，檢測線顏色隨著沙丁胺醇添加濃度的增大而逐漸變淺，說明樣品提取方法有效。經過多次重復實驗，最終確定所建立的膠體金標記免疫層析試紙條方法在實際樣品中的檢出限為5μg/L。對于GPG標記的試紙條，標準品添加濃度依次是0、10、25、50μg/L，4種樣品的試紙條結果如圖5所示。

圖5　4種樣品的添加回收試驗結果Fig.5 The recovery experiments resultof four spiked sam ples

經過多次試驗，GPG標記免疫層析試紙條方法在實際樣品中的檢出限為10μg/L。

3　結論

總而言之，論文選取膠體金和GPG兩種材料進行抗體標記，優化建立免疫層析試紙條方法，并用于動物源性食品中沙丁胺醇殘留的檢測。實驗數據得出，膠體金標記免疫層析試紙條方法檢出限為2.0μg/L，樣品檢出限為5μg/L，檢測時間為5min；GPG標記免疫層析分析方法檢出限為5.0μg/L，樣品檢出限為10μg/L，檢測時間為5min。通過比較發現：傳統的膠體金在實驗體系中靈敏度較高。GPG標記抗體方法和用量與膠體金一樣，但最后GPG標記抗體最佳稀釋倍數是6倍稀釋，膠體金是4倍稀釋，相比較而言，GPG標記比膠體金節約抗體。目前免疫膠體金技術發展很快，也相當成熟，實驗結果采用膠體金作為標記物靈敏度略高，而GPG納米材料，批間差異小，穩定性優于膠體金。在今后的研究中，可以嘗試將膠體金與GPG復配使用，標記不同的抗體。膠體金在硝酸纖維素膜上呈現紅色條帶，GPG在硝酸纖維素膜上呈現黑色條帶，用于多殘留檢測時，由于檢測線顏色不同，可以更加直觀清晰地觀察到檢測結果，實現多元化檢測。

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Study on the Application of Immunochromatographic Test Strip for the Determ ination of Salbutamol

LIU Bing，WANG Ling-ling，TONG Bei，FENG Jiu-hui，SHENG Wei，ZHANG Yan，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nurtrition and Safety Ministry of Education ofChina，The Schoolof Food Engineering and Biotechnology of Tianjin University ofScience and Technology，Tianjin 300457，China）

Colloidal gold and nanogold-polyaniline-nanogold microspheres（GPGs）were labeled purified salbutamolpolyclonalantibodies，respectively.And then theywere spraide on glass fibermat，the coating antigen and goatanti-rabbits econdary antibody were fixed to nitrocellulose membrane as test line and control line respectively.After drying assembled teststrip，the immunochromatographic strip for the determination ofsalbutamol were deceloped.The sensitivity and stability of the test strip were studied and it was applied in the visual detection of salbutamol residued in animal food（pork，beef，lamb and liver）.Itwas found that the detection limitof colloidalgold immunochromatographic teststripwere 5μg/L in samples，while the detection limitof immunochromatographic rapid teststrip labeled by GPGwere10μg/L.

salbutamol；colloidalgold；GPG；immunochromatographic teststrip

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.028

質檢公益性行業科研專項（201310146）

劉冰（1979—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品安全檢測。

王碩（1969—），男，教授，研究方向：食品安全檢測。

2015-11-04