一株黑曲霉creA基因的克隆與序列分析

孫海彥，黎娟華，劉恩世，易小平，楊景豪，彭明

（中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南海口571101）

一株黑曲霉creA基因的克隆與序列分析

孫海彥，黎娟華，劉恩世，易小平，楊景豪，彭明*

（中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南海口571101）

本研究從一株產生淀粉糖化酶的黑曲霉中克隆到了碳源代謝阻遏因子creA基因的DNA及cDNA序列。序列分析表明，該creA基因的DNA和cDNA序列編碼區長度均為1 284 bp，這說明該基因不含內含子，共編碼427個氨基酸，氨基酸序列中共含有1個潛在的糖基化位點，軟件預測出creA基因編碼的蛋白分子量約為48 kDa，等電點為9.6。該研究為今后研究黑曲霉生淀粉糖化酶的產酶調控機理奠定了基礎。

黑曲霉；creA；克隆；序列分析

淀粉酶是催化淀粉中糖苷鍵水解的酶類的總稱，是食品工業中一種重要的酶類，生淀粉酶是指在低于淀粉糊化溫度下，能直接水解不經過蒸煮糊化的生淀粉顆粒的酶類［1］。與目前工業上應用的淀粉酶相比，生淀粉酶的主要特點是：可以在較低的溫度下，直接分解未經高溫處理、未糊化的生淀粉晶體顆粒，從節約能源的角度考慮，研究和開發生淀粉酶具有重要的意義［2］。由于生淀粉酶具有良好的應用前景，近年來引起了國內外研究者的廣泛興趣，國內外研究人員在生淀粉酶的研究領域做了很多工作。主要包括生淀粉酶高產菌的選育［3］、產酶培養基和發酵條件的優化［4］、酶的純化和性質研究［5］、酶的應用研究［6］、基因工程［7］等。但是目前關于生淀粉酶誘導調控的機理的研究還比較少。據報道creA蛋白是絲狀真菌中普遍存在的一種碳源代謝阻遏負調控因子［8］，在絲狀真菌中creA蛋白阻遏靶基因表達的機制也比較保守，主要是通過creA蛋白與靶基因啟動子的結合，阻止RNA聚合酶與啟動子的結合，進而阻遏靶基因表達［9］。通常敲除或突變creA基因后會解除或者部分解除碳源代謝阻遏效應，瑞氏木霉中creA基因的敲除可以提高纖維素酶的表達水平2倍～30倍［10］。由此可見，Aspergillusniger F-01是某些酶的合成調控的關鍵因子。1993年Mary等報道creA是黑曲霉碳源阻遏效應中的負調控因子［11］。1997年George等利用紫外線誘變使黑曲霉中的creA突變后，得到的突變株在合成阿拉伯糖水解酶時存在不同程度的解除碳源代謝阻遏現象［12］。

在前期研究中我們篩選到一株生淀粉糖化酶產生菌Aspergillusniger F-01，本研究克隆了該菌種的creA基因，并對其序列進行分析，為今后通過creA基因來研究該菌種產生淀粉糖化酶的調控機理奠定了一個實驗基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑基因組

Aspergillus niger F-01菌種由本試驗選育保藏。pMD18-T vector載體，Top10、Taq（聚合）酶、T4 DNA連接酶、DNAMarker、dNTPs、10×PCR Buffer（TaKaRa公司），DNA、RNA提取及反轉錄試劑盒（TIANGEN公司），膠回收試劑盒（Omega）。

1.2儀器與設備

PCR儀：TaKaRa；離心機：eppendorf；紫外分光光度計：NanoDrop；DYY-8C型電泳儀：北京六一儀器廠；凝膠成像分析儀：Bio-Rad。

1.3試驗方法

1.3.1AspergillusnigerG-1125RSDG基因的克隆

1.3.1.1引物設計

應用Vector.NTI.Advance.v10.3軟件設計一對特異性引物：CreA-F：GTCGGTCTTGGGACAAGCTTCA CATG；CreA-R：TTCGAACTAGAAGCGT-TCTGCCAAGT。由上海生物工程有限公司合成。

1.3.1.2DNA克隆

以提取的Aspergillusniger F-01基因組DNA為模板，用合成的引物進行PCR擴增，PCR反應體系：Taq 0.5μL；10×PCRBuffer5μL；dNTP 4μL，引物20 pmol；模板2.5μL，無菌水37μL。反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸2 min，退火溫度為58℃，25個循環；最后72℃延伸10min。擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.1.3cDNA的克隆

以提取的菌體總RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一鏈，反應條件為42℃，60min，70℃，15min。然后以反轉錄合成的cDNA第一鏈為模板，采用DNA克隆相同的方法克隆基因的cDNA。

1.3.1.4基因的鑒定

將回收純化的PCR產物連接到pMD18-T vector載體上，并轉化大腸桿菌Top10菌株的感受態細胞，然后送測序。

1.3.2基因的序列分析

采用ncbi，http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/，vectorNTI11.5.1，DNAstar、signalp 4.1 server、等數據庫和軟件，分析RSDG基因的同源性、內含子、推導蛋白的氨基酸序列，并對編碼蛋白的等電點、信號肽、糖基化位點等性質進行預測。

2　結果與分析

2.1Aspergillusniger F-01的creA DNA和cDNA克隆的結果

Aspergillus niger F-01的基因組DNA和RNA的提取結果見圖1和圖2。分別以基因組DNA及總RNA反轉錄產物為模板的目標基因克隆結果如圖3所示。

圖1　Aspergillusniger F-01的基因組DNAFig.1 Genom ic DNA of Aspergillusniger F-01

圖2　Aspergillusniger F-01的總RNAFig.2 TotalRNA of Aspergillusniger F-01

圖3　以基因組DNA及總RNA反轉錄產物為模板的creA克隆結果Fig.3 Cloning of creA using genom ic DNA and cDNA from Aspergillusniger F-01

由圖3可以看出，creA的DNA和cDNA片段長度大小基本一致，略大于1 000 bp。

2.2序列分析

經膠回收送測序發現，所得基因的序列無論是從DNA或cDNA為模板，都得到長度為1 284 bp（包括終止子），并且序列比對的一致性為100％，這說明該Aspergillusniger F-01的creA基因無內含子，該研究結果與Mary等關于黑曲霉creA的報道是一致的。經過序列比對發現，Aspergillusniger F-01 creA的基因序列與已經完成全基因測序的高產檸檬酸的黑曲霉菌種的creA序列完全相同。與Mary等報道的黑曲霉creA的基因同源性為99％［11］，而與Aspergillusaculeatus的同源性僅為80％，這說明曲霉中同一個種的creA序列比較保守，而同是曲霉屬不同種間creA的同源性較低，該基因DNA序列與曲霉屬的其它相關微生物的creA序列比對見圖4。

該基因翻譯成氨基酸序列是：

圖4　Aspergillusniger F-01和曲霉屬的其它相關微生物的creA序列的比對Fig.4 Blastof creA in Aspergillusniger F-01 and other relatedm icroorganism from Aspergillus sp.

DNAstar軟件分析得出，該基因翻譯的蛋白質由427個氨基酸組成，預測的分子量是48 kDa，等電點是9.6，具有一個潛在的糖基化位點N19，該蛋白具有典型的鋅指結構，該類蛋白是一種DNA結合蛋白，通過與靶基因啟動子區域DNA的結合從其影響基因的轉錄。Aspergillusniger F-01 creA蛋白的氨基酸序列與ncbi數據庫中已有creA蛋白的的同源性見表1。

表1　Aspergillusniger F-01與其它微生物來源的creA蛋白氨基酸序列同源性比較Table1 Comparison ofam ino acidic sequencesderived from creA from Aspergillusniger F-01 and otherm icroorganism s

由表1可知，Aspergillusniger F-01 creA蛋白的氨基酸序列Aspergillus niger CBS513.88的creA蛋白的氨基酸序列完全一致，和另一株黑曲霉Aspergillus niger ATCC 1015 creA蛋白的氨基酸序列的同源性是99％，和曲霉屬中其它種的creA蛋白同源性在81％～93％之間，而和ncbi數據庫中其它屬微生物的creA蛋白的同源性在53％～85％之間，這說明不同微生物的creA蛋白的同源性差異與種之間的進化距離基本呈正相關趨勢。

3　結論

本研究從Aspergillusniger F-01克隆到了creA基因的DNA及cDNA序列，序列分析表明，該基因編碼區全長1 284 bp，不含內含子，編碼一個由427個氨基酸組成的蛋白，該基因DNA序列與已經完成全基因組測序的檸檬酸高產菌Aspergillus niger CBS513.88的creA基因完全一致，與Mary等報道的黑曲霉creA基因同源性為99％［11］，這說明黑曲霉中creA基因是比較保守的序列；同時經過軟件預測得出，該基因編碼蛋白的分子量約是48 kDa，等電點是9.6，和其它已經報道的黑曲霉creA編碼蛋白質的氨基酸序列同源性在99％～100％之間，和曲霉屬中其它種的creA編碼蛋白質的氨基酸序列同源性在81％～93％之間，而和其它屬微生物的編碼蛋白質的氨基酸序列同源性在53％～85％之間。

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Cloning and Sequence Analysis of creA Gene from A Aspergillus niger Strain

SUN Hai-yan，LI Juan-hua，LIU En-shi，YI Xiao-ping，YANG Jing-hao，PENG Ming*
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，Hainan，China）

DNA and cDNA of carbon catabolite repressor，creA，in a raw-starch-digesting-producing Aspergillusniger F-01were cloned in thisstudy.Theanalysisofsequences revealed that length ofDNA and cDNA of thisgene both were 1 284 bp，which demonstrated that the gene containsno intron.The gene encodes a protein of 427 amino acidswith one potential glycosylation sites.The calculatedmolecularweight and isoelectric pointof the protein were 48 kDa and 9.6，respectively.The researchmade a base for the elucidating regulation mechanism of raw-starch-digesting-glucoamylase production in Aspergillusniger F-01.

Aspergillusniger；creA；cloning；sequenceanalysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.037

國家自然科學基金（31000029）；海南省自然科學基金（ZDFD 20120765）；863重點項目（2012AA101204）；海南省研究生創新科研課題（Hyb2011-4）；海南省引進集成應用專項（YJJC2011004）；海南省重大科技項目（ZDZX2013023-1）

孫海彥（1979—），女（漢），副研究員，碩士，研究方向：微生物學。

彭明（1956—），男（漢），研究員，博士，研究方向：生物技術。

2015-01-16