中國泡菜乳桿菌種質資源調查

代富英，戴雨珂，王海娟，蘇森森，杜昕，潘渠，*

（1.成都醫學院病原生物學教研室，四川成都610500；2.成都醫學院公共衛生系，四川成都610500）

中國泡菜乳桿菌種質資源調查

代富英1，戴雨珂2，王海娟1，蘇森森1，杜昕1，潘渠1，*

（1.成都醫學院病原生物學教研室，四川成都610500；2.成都醫學院公共衛生系，四川成都610500）

為了進一步探索中國泡菜中乳桿菌種質資源，使用自主研發的乳桿菌快速檢出方法和16sRNA基因測序鑒定技術，對采自14個省級行政區的81份泡菜樣品進行了檢測。乳桿菌分離率為45.7％，證明中國泡菜中有豐富的乳桿菌種質資源。共分離到7種44株乳桿菌。其中植物乳桿菌菌株占分離乳桿菌菌株總數的79.5％，表明泡菜中乳桿菌的種類以植物乳桿菌為主。在重慶分離到了2012年在臺灣發現的福菜乳桿菌，再次證明了該菌種在自然界中的存在。中國泡菜中的乳桿菌種質資源存在地區差異，乳桿菌分離率較突出的地區分別是云南（200％），重慶（125％），江蘇（133％）和東北（100％）。湖南泡菜中可能較為缺乏乳桿菌種質資源。

中國泡菜；乳桿菌；16sRNA；益生菌；種質資源

乳桿菌（Lactobacillus）是一種公認安全無害的微生物，其特征為革蘭染色陽性、無芽胞，能夠分解糖分產生乳酸的一類桿菌。乳桿菌廣泛存在于各類發酵食品中，目前已經從乳制品及泡菜等碳源豐富環境中分離出一百多種乳桿菌［1］。目前的研究表明乳桿菌有明確的益生作用，市場上已經開發出多種乳桿菌制劑用于維持胃腸道健康和胃腸道疾病治療。進一步的研究表明，乳桿菌的益生作用可能通過腦腸軸傳遞到大腦，可以使人保持良好的情緒，有可能將乳桿菌開發為治療自閉癥、焦慮癥和抑郁癥等精神心理性疾病的藥物［2-3］。

中國制作泡菜的傳統由來已久，在川渝等地尤為明顯。我們前期的工作表明泡菜中有豐富的乳桿菌資源［4］，可能有乳桿菌新種有待于我們去發現。從周邊喜愛制作泡菜的國家的研究來看，我們也有理由預期中國泡菜中有新的乳桿菌，比如韓國，在泡菜中發現了5個乳桿菌新種，分別命名為：Lactobacillus koreensis、Lactobacillus yonginensis［5］、Lactobacillus ginsenosidimutans［6］、Lactobacillus kimchicus和Lactobacillus kimchii；日本在泡菜中發現了6個乳桿菌新種和亞種，分別命名為：Lactobacillussenmaizukei、Lactobacillusdelbrueckii subsp.Sunkii［7］、Lactobacillus kisonensis、Lactobacillus otakiensis、Lactobacillus rapi和Lactobacillussunkii。

為了進一步探索中國泡菜中乳桿菌種質資源，我們使用自主研發的乳桿菌快速檢出方法，對81份泡菜樣品進行了檢測。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

乳桿菌PCR快速檢出技術中的引物序列和克隆細菌16s RNA基因的通用引物序列由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成；小量質粒提取試劑盒購自美國omega公司；DNA連接試劑盒購自Promega公司；exTaq酶、TVector pMD 19試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；其它化學試劑購自上海生物工程公司。

Veriti型PCR儀：ABI公司；GenePulser X cellTM型電轉化儀、UniversalHood II型凝膠電泳成像儀：美國BIO-RAD公司；1389型超凈工作臺、LEGENDMicro17型高速離心機：Thermo公司；mLINE型移液器：芬蘭Biohit公司。

1.2采樣與分離培養

在四川省采樣50份，在外省采樣31份，共采集泡菜樣品81份，泡菜樣品采集地列表見表1。

表1　泡菜樣品采集地列表Table1 The placesof collection of pickle samples

將泡菜樣品中的液體成分使用接種劃線的方法接種至MRS培養基上，MRS培養基偏酸性，是適合乳桿菌生長的培養基，可以富集乳桿菌。經過37℃靜置培養18 h～48 h后，培養基上長出菌落，初步肉眼判斷不同的菌落，每個樣品分別挑出3個菌落繼續劃線分離2次，分離純化泡菜樣品中的細菌。最后每份泡菜只取3個菌落進行鑒定。

MRS培養基配方：蛋白胨10 g、牛肉粉5 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1mL、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、酵母粉4 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、檸檬酸二銨2 g、去離子水1 L、115℃高溫滅菌20min［8］。

1.3革蘭染色初步鑒定

革蘭染色為陽性，菌體為桿狀，觀察不到芽胞的菌株進入下一步鑒定。隨乳桿菌菌種不同其桿狀長短有別，短桿狀與球狀極易混淆。當實驗菌株的菌體不呈典型球狀時，均認為是短桿狀。

1.4PCR檢出

對已通過革蘭染色初步鑒定的菌株使用乳桿菌PCR快速檢出技術（專利號：ZL201110205040.6）［9］，檢出其中的乳桿菌菌株，為避免漏檢，對首次檢測為陰性的菌株復檢一次。

1.5測序鑒定

PCR擴增乳桿菌菌株16s RNA基因［4］，克隆后送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。根據16sRNA基因序列，將乳桿菌菌株鑒定到種。

2　結果與討論

2.1革蘭染色結果

通過MRS培養基上的劃線分離和革蘭染色鑒定，從81份泡菜樣品分離了94株菌株。其中有65株革蘭陽性無芽胞桿菌菌株，6株革蘭陽性有芽胞桿菌菌株，15株革蘭陽性無芽胞球菌菌株，7株酵母菌菌株，1株革蘭陰性桿菌菌株。65株革蘭陽性無芽胞桿菌菌株進入下一步鑒定。

分離到的革蘭陽性無芽胞桿菌大多數為較粗較長的桿菌，少數為短桿型。在MRS培養基上，這些革蘭陽性無芽胞桿菌均長出乳白色的圓形、突出、光滑的小菌落。

2.2PCR檢出和16sRNA基因測序結果

利用乳桿菌PCR快速檢出技術，對革蘭染色鑒定為革蘭陽性無芽胞桿菌的65菌株進行鑒定，初步檢出乳桿菌數目為55株。再通過16s RNA基因全長測序鑒定后，上述55株乳桿菌菌株除4株被鑒定為魏斯氏菌外，其余51株均吻合已有的乳桿菌16sRNA基因序列特征，其中有7株菌株的16sRNA基因序列100％相同，并來自同一泡菜樣品，應算作同一菌株，因此此次共分離乳桿菌菌株44株，81份泡菜樣品中分離的乳桿菌種類和數量表見表2（魏斯氏菌是革蘭陽性的短桿菌，是乳桿菌屬近緣菌屬，我們的乳桿菌PCR快速檢出技術無法區別）。

表2　81份泡菜樣品中分離的乳桿菌種類和數量表Table2 The speciesand amountof Lactobacillussp.isolated from Chinesepicklesam ples

本次調查的81份泡菜樣品中有37份樣品分離到乳桿菌，乳桿菌分離率為45.7％。相比上一次初步調查（36.5％），乳桿菌分離率有所上升。兩次調查都證明泡菜中富含乳桿菌種質資源。分離的44株乳桿菌菌株分別屬于7個種，分別是植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、清酒乳桿菌（Lactobacillussakei）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、食品乳桿菌（Lactobacillusalimentarius）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、福菜乳桿菌（Lactobacillus futsaii）和彎曲乳桿菌（Lactobacilluscurvatus）（表2）。分離的44株乳桿菌菌株中有35株是植物乳桿菌菌株，占分離乳桿菌菌株總數的79.5％。該結果表明泡菜中乳桿菌的種類以植物乳桿菌為主，符合植物乳桿菌與植物伴生的特點。福菜乳桿菌是2012年在我國臺灣地區首次發現的乳桿菌新種［10］，本次調查，我們在重慶分離到了3株福菜乳桿菌，再次證明了該菌種在自然界中的存在，并將其分布從臺灣擴展到了重慶。

2.3分離乳桿菌菌株在中國的分布

中國共34個省級行政區，我們從傳統上喜愛制作泡菜的地區采集泡菜樣品，在14個省級行政區采取了81份泡菜樣品。8個行政區分離出了乳桿菌，分別是：四川19株，云南10株，重慶5株，江蘇4株，貴州1株，北京3株，遼寧1株，吉林1株。

中國泡菜分南北兩系，南方以四川泡菜為代表，流行于云貴川渝四地，北方以東三省的朝鮮族辣白菜為代表。川渝兩地為南派泡菜發源地，我們在這兩個地區密集采樣，采集了54份泡菜樣品，分離出3種24株乳桿菌，占總分離乳桿菌株數的54.5％。在四川分離的乳桿菌最多。在北派泡菜發源地東北地區僅采集了2份泡菜樣品，其乳桿菌分離率達到了100％。乳桿菌分離率較突出的地區還有3個，分別是云南（200％），重慶（125％）和江蘇（133％）。在湖南采樣6份，都沒有分離到乳桿菌菌株，分離到的是4株魏斯氏菌菌株。魏斯氏菌也是乳酸菌，能像乳桿菌一樣發酵糖類產生乳酸。可能湖南泡菜的酸化過程主要是魏斯氏菌在起作用，湖南泡菜中可能較為缺乏乳桿菌種質資源。

分離的7種乳桿菌菌種的分布情況為：云南4種，重慶3種，江蘇2種，四川1種，貴州1種，北京1種，遼寧1種，吉林1種。較為突出的是云南和重慶，可以肯定兩地的泡菜中存在豐富的乳桿菌種質資源。四川雖然分離到了最多的乳桿菌菌株，但都是植物乳桿菌，表明四川的泡菜中乳桿菌的含量雖然豐富，但種類可能比較單一。

已有的文獻都表明四川與云南地區乳桿菌種質資源豐富［11］。我們的研究進一步證實了該結論。北派泡菜中乳桿菌研究起步較晚，但取得了很好的成果，發現了5種新的乳桿菌：牡丹江乳桿菌（Lactobacillusmudanjiangensis）、松花江乳桿菌（Lactobacillus songhuajiangensis）、嫩江乳桿菌（Lactobacillus nenjiangensis）、黑龍江乳桿菌（Lactobacillus heilongjiangensis）和香坊乳桿菌（Lactobacillusxiangfangensis）［12-14］。

3　結論

我們的研究表明，中國泡菜中存在豐富的乳桿菌種質資源，其種類以植物乳桿菌為主，分布上存在地區差異。湖南泡菜中可能較為缺乏乳桿菌種質資源。云南和重慶地區的泡菜中有豐富的乳桿菌種質資源，進一步的調查可能發現乳桿菌新種。乳桿菌是益生菌，是一種寶貴的資源，對中國傳統發酵食品中蘊含的乳桿菌種質資源有進一步發掘的必要。

［1］Endo A，Irisawa T，Futagawa-Endo Y，etal.Lactobacillus faecis sp. nov.，isolated from animal faeces［J］.Int JSystEvolMicrobiol，2013，63（12）：4502-4507

［2］Bravo JA，Forsythe P，Chew M V，etal.Ingestion of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA receptor expression in amouse via the vagusnerve［J］.Proc Natl Acad SciUSA，2011，108（38）：16050-16055

［3］Sharon G，Hyde ER，McCue T，etal.Microbiotamodulatebehavioral and physiologicalabnormalitiesassociated with neurodevelopmental disorders［J］.Cell，2013，155（7）：1451-1463

［4］楊四佳，王穎，李宇婷，等.泡菜中乳桿菌的快速檢出和乳桿菌質粒資源的初步調查［J］.食品與生物技術學報，2013，32（6）：639-644

［5］YiE J，Yang JE，Lee JM，etal.Lactobacillusyonginensissp.nov.，a lactic acid bacterium with ginsenoside converting activity isolated from Kimchi［J］.Int JSystEvolMicrobiol，2013，63（9）：3274-3279

［6］Jung HM，Liu QM，Kim JK，etal.Lactobacillusginsenosidimutans sp.nov.，isolated from kimchiwith the ability to transform ginsenosides［J］.Antonie Van Leeuwenhoek，2013，103（4）：867-876

［7］Kudo Y，Oki K，Watanabe K.Lactobacillus delbrueckii subsp. sunkiisubsp.nov.，isolated from sunki，a traditional Japanese pickle［J］.Int JSystEvolMicrobiol，2012，62（11）：2643-2649

［8］潘渠，叢延廣，侯瑞，等.嗜酸乳桿菌3-磷酸甘油醛脫氫酶的分離純化［J］.免疫學雜志，2009，25（4）：461-464

［9］潘渠，楊維華，王穎，等.設計乳桿菌特異性引物并運用菌落PCR技術快速檢出和鑒定四川泡菜中的乳桿菌［J］.微生物學通報，2011，38（8）：1300-1305

［10］Chao SH，Kudo Y，TsaiYC，etal.Lactobacillus futsaiisp.nov.，isolated from fu-tsai and suan-tsai，traditional Taiwanese fermented mustard products［J］.Int JSystEvolMicrobiol，2012，62（3）：489-494

［11］周光燕，宋萍，王柱，等.西南菌種站乳酸菌菌種資源的收集整理及性能分析［J］.食品與發酵科技，2012，48（4）：15-19

［12］Gu C T，LiCY，Yang L J，et al.Lactobacillusmudanjiangensis sp. nov.，Lactobacillus songhuajiangensis sp.nov.and Lactobacillus nenjiangensis sp.nov.，isolated from Chinese traditional pickle and sourdough［J］.Int JSystEvolMicrobiol，2013，63（12）：4698-4706

［13］Gu C T，LiCY，Yang L J，etal.Lactobacillus heilongjiangensis sp. nov.，isolated from Chinese pickle［J］.Int JSystEvolMicrobiol，2013，63（11）：4094-4099

［14］Gu CT，Wang F，LiCY，etal.Lactobacillus xiangfangensis sp.nov.，isolated from Chinese pickle［J］.Int JSyst EvolMicrobiol，2012，62（4）：860-863

Investigation on Lactobacillus Germp lasm Resources of Chinese Pickle

DAI Fu-ying1，DAI Yu-ke2，WANG Hai-juan1，SU Sen-sen1，DU Xin1，PAN Qu1，*
（1.Department of Pathogenic Biology，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，Sichuan，China；2.Department of Public Health，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，Sichuan，China）

For investigation on Lactobacillus germplasm resources of Chinese pickle，81 samples of Chinese pickle from 14 provinces were collected，and Lactobacillus strains from these samples were isolated using 16 s RNA gene sequencing and rapid-detection PCR technology for Lactobacillus which was designed by our selves.The isolating rate of Lactobacillus strains was 45.7％，which showed there had rich Lactobacillus germplasm resources in Chinese pickle.7 Lactobacillus sp.and 44 Lactobacillus strainswere detected.79.5％ of isolated Lactobacillus strainswere Lactobacillusplantarum strainswhich indicated the dominance Lactobacil－lussp.in Chinese picklewas Lactobacillusplantarum.3 Lactobacillus futsaii strainswere isolated in Chongqing，whichwas first found atTaiwan in 2012.Thereare regionaldifferences in thegermplasm resourcesof Lactobacillus in Chinese pickle.The isolation rate of Lactobacillus strains ismore prominent in Yunnan（200％），Chongqing（125％），Jiangsu（133％）and Northeast region（100％）.Hunan pickles may be lack of Lactobacillus germplasm resources.

Chinesepickle；Lactobacillus；16sRNA；probiotic；germplasm resources

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.038

國家自然科學基金（31170007）；四川省教育廳科技基金重點項目（14ZA0219）；成都醫學院病原生物學學科建設項目（CYXK2012005）；成都醫學院科研基金項目（CYZ13-019）

代富英（1978—），女（漢），講師，碩士，醫學微生物學專業。

潘渠（1973—），男（漢），副教授，博士，主要從事益生菌研究。

2015-11-04