拮抗菌Burkholderia contaminans對玫瑰香葡萄采后灰霉病的抗性誘導

范三紅，李 靜，施俊鳳

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所，山西 太原 030031）

拮抗菌Burkholderia contaminans對玫瑰香葡萄采后灰霉病的抗性誘導

范三紅1，李 靜1，施俊鳳2

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所，山西 太原 030031）

以玫瑰香葡萄為實驗試材，研究洋蔥霍爾德氏菌（Burkholderia contaminans B-1）對玫瑰香葡萄采后灰霉病的抗性誘導機理，對經拮抗菌處理貯藏后果實的腐爛率及其抗性相關物質進行測定。結果表明：拮抗菌B. contaminans B-1可有效降低玫瑰香葡萄采后腐爛率，與對照相比，果梗腐爛率降低69.58%，果肉腐爛指數降低63.93%。拮抗菌處理對果實苯丙烷代謝途徑、活性氧代謝途徑和其他抗性相關酶類活性均有影響。與對照相比，B. contaminans B-1處理可提高葡萄果實苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和多酚氧化酶（PPO）活性，促進過氧化氫（H2O2）含量積累，延緩過氧化氫酶（CAT）活性峰值出現的時間。此外， 拮抗菌處理也可以誘導果實病程相關蛋白幾丁質酶（CHI）和β-1,3葡聚糖酶（GLU）活性的上升。

玫瑰香葡萄；生物防治；抗性誘導

玫瑰香葡萄又名麝香葡萄，因其含糖量高、著色好、麝香味濃而受到消費者喜愛[1]，與其他品種相比，玫瑰香葡萄皮薄、含汁量大，在貯藏保鮮期間極易發生腐爛[2]。灰霉病是鮮食葡萄采后常見的一種病害，其病原菌灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）寄主范圍廣，耐低溫，在葡萄貯藏環境中極易繁殖，直接影響其商品價值及食用價值[3]。果實采后生防技術是近年來發展起來的一種“綠色防腐”技術，與傳統的SO2熏蒸處理相比，該技術具有對人畜安全無殘毒、對環境無污染、對病原菌無抗性、且不破壞生態平衡等優點[4]。

果實采后抗性激發子主要包括生物因子和非生物因子。這些因子通過激發植物自身的抗病能力來有效抵御或殺死病原菌，從而降低腐爛[5]。生物因子主要指一些生防菌株，目前已有多種生防菌株誘導果實產生抗性的相關報道，如酵母拮抗菌P. membrunefacaen可以降低桃果實由葡枝根霉（Rhizopus stolonafer）引起的采后軟腐病的發病率，還可提高果實過氧化物酶（peroxidase，POD）、多酚氧化酶（polyphenloxidase，PPO）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）等酶活性[6]；Droby等[7]采用拮抗菌Candida oleophila噴灑葡萄表面，可顯著提高其果實組織中幾丁質酶（chitinase，CHI）和β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GlU）活性。本實驗以洋蔥霍爾德氏菌（Burkholderia contaminans B-1）為生防菌株，研究其對玫瑰香葡萄采后抗病性的誘導機理，以期為葡萄采后生物防治技術的發展提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

玫瑰香葡萄采自山西省太谷縣玫瑰香種植基地，達到商品成熟期時進行采摘，采摘當天運回實驗室預冷并貯藏于0 ℃冷庫中。

洋蔥霍爾德氏菌由本實驗室分離于杏果實表面，并根據核糖體26S D1/D2區和ITS區核甘酸序列比對及生理生化特性進行鑒定；灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）分離于自然發病的葡萄果實，并通過ITS區和形態特征進行鑒定。

細菌培養基為LB培養基[8]：酵母膏10.0 g/L、蛋白胨 10.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、pH 7.2；真菌培養基為PDA培養基[9]：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L、pH 7.0。

對氨基苯磺酸、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、鄰苯二酚 天津市光復精細化工研究所；愈創木酚、a-萘胺、昆布多糖、甲殼素、核黃素、蝸牛酶 北京索萊寶科技有限公司；β-巰基乙醇、四氮唑藍 美國Amresco公司。

1.2 儀器與設備

LS-B50L-I型立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫療設備有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；HPG-280BX光照培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；GL-20G-II離心機 上海安亭科學儀器廠；Ultrospec 2000紫外-可見分光光度計美國Pharmacia公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗材料的制備與果實處理

1.3.1.1 洋蔥霍爾德氏菌發酵原液的制備

將-80 ℃保存的拮抗菌B-1在LB固體培養基活化后，挑取經活化的LB固體培養基上的拮抗菌B. contaminans B-1單菌落在300/1 000 mL LB液體培養基中28 ℃條件下200 r/min振蕩培養24 h。

1.3.1.2 霉菌孢子懸浮液制備

將灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）于PDA平板培養7 d后，刮取分生孢子，采用血球計數法用無菌水配制成濃度為1.0×l05spores/mL的孢子懸浮液。

1.3.1.3 果實貯藏效果樣品處理

挑選外觀無機械傷且成熟度一致的玫瑰香葡萄于拮抗菌LB不同濃度（a.發酵原液；b.稀釋5 倍發酵液；c.稀釋10 倍發酵液）培養液中浸泡2 min（對照不進行處理）后分別置于滅菌塑料筐（每筐20 串，每串約20 粒果實）中，于0 ℃條件下保濕貯藏70 d后檢查。實驗重復3 次。

1.3.1.4 果實抗性相關物質指標測定樣品處理

挑選無機械傷且成熟度一致的玫瑰香葡萄約750 粒，將其隨機等量分為對照組和處理組，將兩組果實于2%的次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，無菌風吹干，用滅菌針在其赤道部位刺直徑4 mm深度3 mm的傷口，每個葡萄各刺1 個傷口。處理組在傷口處加30 μL B. contaminans的24 h發酵液，對照組加30 μL無菌水。2 h后于各傷口處再加15 μL霉菌孢子懸浮液，無菌風吹干后于25 ℃培養箱中保濕培養6 d。每天分別取50 粒處理組和對照組果實，于其傷口處病斑與健康組織交接部位的果肉作為實驗材料，液氮處理后于-80 ℃條件下貯存待用。實驗重復3 次。

1.3.2 果實貯藏效果測定

對貯藏70 d后的果實和果梗腐爛程度進行調查，根據腐爛程度將果實分級后稱質量，并按（1）、（2）分別計算果梗腐爛率、果實腐爛指數。

果梗發生霉變為腐爛，未發生霉變為正常。

根據果實腐爛程度分為5 個等級，分級標準如下：其中0級：果實完好，無任何腐爛；1級：果實表面現輕微斑點，腐爛面積占果面的1/3以下；2級：果實果面有明顯腐爛，腐爛面積約占果實表面的1/3～1/2；3級：果實超過果面的1/2腐爛，但果實尚有一定硬度；4級：果實整體完全潰爛。將果實分級后分別稱質量。

1.3.3 果實抗性相關物質指標測定

1.3.3.1 苯丙烷類代謝途徑相關酶的活性測定

在植物抗病反應中，許多重要的抗菌物質都可在苯丙烷類代謝途徑中產生，PAL和POD、PPO分別是該代謝途徑的第一關鍵酶和末端相關酶[10]。實驗中PAL活性測定方法參照Assis等[11]的方法加以改進，酶活性以每小時波長290 nm處吸光度增加0.01為一個酶活單位（U）。PPO活性測定采用鄰苯二酚法[12]，以每分鐘波長398 nm處吸光度上升0.1作為一個酶活單位（U）。POD活性測定采用愈創木酚法[13]，以每分鐘波長460 nm處吸光度上升0.01作為一個酶活單位（U）。

1.3.3.2 活性氧代謝途徑相關指標的測定

活性氧與植物的抗病性密切相關，植物受病原菌侵染時體內會積累過氧化氫（H2O2）超氧陰離子自由基（O2-·)，同時活性氧清除和保護相關酶過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和POD活性也會隨之發生變化。CAT活性參照Wang等[14]的方法加以改進，以每分鐘波長240 nm處吸光度下降0.001作為一個酶活單位（U）。SOD活性參照Prochazkova等[15]方法加以修改，以每毫克蛋白的反應體系抑制氮藍四唑光化還原的50%為一個SOD活性單位（U/g）。H2O2含量參考杜淑紅等[16]的方法進行改進，含量以μmol/mL表示。·產生速率的測定參照王愛國等[17]方法加以修改，產生速率以nmol/（min·g）表示。

1.3.3.3 其他抗性相關酶活測定

CHI和GlU是植物中普遍存在的抗性物質，它們可分別水解真菌細胞壁主要組分幾丁質和1,3-葡聚糖。CHI和GLU活性分別參考趙妍[18]的方法加以改進，CHI以每毫升上清液每小時分解膠體幾丁質所釋放1 μmol N-乙酰葡萄糖胺作為一個酶活單位（U），GLU以每毫升上清液每小時分解產生1 mg葡萄糖作為一個酶活單位（U）。

1.4 數據統計與分析

用軟件DPS 7.0進行數據統計分析和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌對玫瑰香葡萄采后貯藏自然腐爛抑制效果

由圖1可知，采用拮抗菌的發酵液處理玫瑰香葡萄，于0 ℃條件下貯藏70 d后，3 個不同濃度的發酵液均能有效抑制葡萄的腐爛（P＜0.05）。對照果梗和果肉大部分發生霉變腐爛，而采用拮抗菌（Burkholderia contaminans）處理后，腐爛程度顯著降低。其中稀釋5 倍的發酵液貯藏效果最好，發酵原液效果次之，稀釋10 倍發酵液效果相對差些。對照果梗的腐爛率達到100%，果肉腐爛指數為67.14%；而稀釋5 倍的發酵液其果梗腐爛率僅為30.42%，果肉腐爛指數僅為3.21%，果梗腐爛率降低69.58%，果肉腐爛指數降低63.93%。

圖1 拮抗菌對葡萄采后貯藏腐爛的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of antagonistic bacterial treatment on postharvest rot rate of grapes

2.2 拮抗菌處理對葡萄果實PAL、POD、PPO活性的影響

PAL作為苯丙烷類代謝第一步反應的關鍵酶，參與植物木質素、植保素和酚類等抗病相關物質的生物合成，PPO氧化酚類物質生成的高毒性醌類物質可限制和毒殺入侵的病原微生物，POD與植物內木質素和植保素的合成及對植物細胞有害的H2O2和O2-·的清除密切相關[19]。

圖2 拮抗菌處理對葡萄采后PAL（A）、POD（BB）和PPO（CC）活性的影響Fig.2 Effect of antagonist bacterial treatment on the activities of PAL (A), POD (B) and PPO (C) of postharvest grape

由圖2A可知，對照和處理的PAL活性均在第1天時達到高峰，且有一個相近的峰值，在隨后的1～5 d，拮抗菌處理過的果實PAL活性穩定高于對照，處理后5 d時，兩者間差異縮小。圖2B中處理組和對照組的POD活性整體呈上升趨勢，前3 d該酶活性差異不大，從第3天開始，處理組的POD活性迅速上升，且數值顯著高于對照，到第5天時，兩者差別縮小。從圖2C可看出，在整個貯藏期間處理組果實的PPO活性顯著高于對照，相比對照不明顯的變化趨勢，實驗組的PPO活性在第1天就開始快速上升，在第3天時達到高峰然后開始下降。

2.3 拮抗菌處理對葡萄果實CAT、SOD活性、H2O2含量和·產生速率的影響

圖3 拮抗菌處理對葡萄采后O2·產生速率（A）、SOD活性（BB）、H2O2含量（C）和CAT活性（D）的影響Fig.3 Effect of antagonist bacterial treatment on· production rate (A), SOD activity (B), H2O2content (C) and CAT activity (D) of postharvest grape

在逆境脅迫下，植物組織最快的抗病反應就是形成大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），主要包括H2O2和·等。活性氧不僅能直接殺害入侵的病原微生物，還與植物的過敏反應密切相關。SOD是防御生物體發生氧化損傷的一種酶類，可通過催化·發生反應生成H2O2和分子氧，在隨后的反應中，H2O2在CAT等物質的作用下轉變為水和分子氧[20]。

2.4 拮抗菌處理對葡萄果實CHI、GLU活性的影響

圖4 拮抗菌處理對葡萄采后CHI（A）和GLU（B）活性的影響Fig.4 Effect of antagonist bacterial treatment on the activities of CHI (A) and GLU (B) in postharvest grape

由圖4A可知，拮抗菌處理的葡萄果實CHI活性顯著高于對照組，隨著貯藏期的延長，對照組CHI活性快速下降，而處理組在第1天的CHI活性略有上升，形成了一個高峰而后下降。由圖4B可知，處理組和對照組在貯藏第1、2天和第4、5天時兩者GLU活性差別不太大，除第1天外處理組較對照組稍有增加。但是兩者區別明顯在于第3天，在第3天時對照組酶活達到最低點，而處理組酶活明顯升高，達到最高點，在該時間點處理組酶活是對照組的3 倍左右。

3 討 論

近年來國內外對葡萄采后貯藏灰霉病的控制主要采用低溫結合SO2熏蒸，此技術雖效果顯著，應用廣泛，但會產生病原微生物抗藥性增加、有害人體健康、環境污染等一系列問題[21]。在本研究中，經洋蔥霍爾德氏菌發酵液浸泡后的玫瑰香葡萄貯藏后其果梗的霉變及果肉的腐爛率顯著低于對照，其中果梗腐爛率降低69.58%，果肉腐爛指數降低63.93%，說明此拮抗菌對葡萄果實具有很好的貯藏保鮮效果。在果蔬貯藏生物防治技術中，誘導抗性是其一個重要方面[22]，苯丙烷代謝活性增強是植物誘導抗性后的典型反應，實驗中經拮抗菌處理的葡萄果實苯丙烷類代謝中第一關鍵酶PAL和末端酶POD、PPO均高于對照，其活性的增強了有利于木質素、植保素、酚類等抗性物質的生物合成，提高了植物對病原菌侵染的抵抗能力，這一結論與前人研究[23]一致。其次拮抗菌處理的玫瑰香果實活性氧代謝較為活躍，一般情況下，在動植物細胞中活性氧的產生與清除均存在著一個動態平衡[24]。實驗中，和對照組相比，拮抗菌處理的葡萄果實在貯藏期的第1天其SOD活性快速上升而CAT活性顯著減少，該變化促使了H2O2在葡萄果實細胞中的積累。因此，在貯藏期的第1天，處理組果實細胞中H2O2含量較高。已有研究[25]證明，H2O2的快速積累在植物的抗病反應中有著重要作用，它不僅具有直接的抗病原微生物功能，且其存在本身就可對病原菌產生傷害。而在貯藏后期處理組的CAT活性顯著高于對照組，使果肉中積累的過多H2O2得到清除，從而避免了果實內活性氧過多而引起的機體損傷。另外本實驗中處理組的CHI、GLU活性均高于對照，該結果與Yao Hongjie等[26]的研究結果符合，他們在研究中也證實CHI和GLU活性的升高與果蔬在貯藏期間表現出的抗病性密切相關。綜上所述，拮抗菌（Burkholderia contaminans B-1）處理作為一種生物防治技術在葡萄采后貯藏中可顯著提高果實的抗病能力，達到防腐保鮮的目的。

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Induction of Disease Resistance against Botrytis cinerea in Postharvest Muscat Grape by Antagonistic Bacterium Burkholderia contaminans

FAN Sanhong1, LI Jing1, SHI Junfeng2
(1. College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Institute of Agricultural Product Storage and Fresh Keeping, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China)

In this study, the mechanism by which the antagonistic bacterium Burkholderia contaminans B-1 induces resistance to Botrytis cinerea in postharvest Muscat grape berry was investigated. The results showed that B. contaminans B-1 reduced significantly the rot rate of postharvest grape berries. Compared with the control, the rot rates of the stem and fruit treated with B. contaminans were decreased by 69.58% and 63.93%, respectively. B. contaminans B-1 could affect the phenylpropanoid metabolic pathway, reactive oxygen species metabolic pathway, and the activities of resistance-related enzymes. Treatment with B. contaminans B-1 enhanced the activities of phenylalanine ammonia-lyase (PAL), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD) and polyphenloxidase (PPO). B. contaminans B-1 also increased hydrogen peroxide (H2O2) content and delayed the peak time of catalase (CAT) activity, and enhanced the activities of resistance-related enzymes, chitinase (CHI) and β-1,3-glucanase (GLU), in grapes.

Muscat grape; biological control; induced disease resistance

10.7506/spkx1002-6630-201602047

Q939.92；TS255.3

A

1002-6630（2016）02-0266-05

范三紅, 李靜, 施俊鳳. 拮抗菌Burkholderia contaminans對玫瑰香葡萄采后灰霉病的抗性誘導[J]. 食品科學, 2016, 37(2): 266-270. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602047. http://www.spkx.net.cn

FAN Sanhong, LI Jing, SHI Junfeng. Induction of disease resistance against Botrytis cinerea in postharvest muscat grape by antagonistic bacterium Burkholderia contaminans[J]. Food Science, 2016, 37(2): 266-270. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602047. http://www.spkx.net.cn

2015-07-09

山西省農業科學院博士后基金項目（BSH-2015JJ-003）；山西省農業科學院自主創新項目（2015ZZCX-16）；國家自然科學基金面上項目（31371868）

范三紅（1963—），男，副教授，碩士，研究方向為食品科學。E-mail：fsh729@sxu.edu.cn