蜂王漿在貯藏過程中5-羥甲基糠醛、10-羥基-2-癸烯酸及精氨酸雙糖苷含量的變化

王露露，董 蕊，范 超，張 晶

（1.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2. 長春科技學院醫學院，吉林 長春 130061）

蜂王漿在貯藏過程中5-羥甲基糠醛、10-羥基-2-癸烯酸及精氨酸雙糖苷含量的變化

王露露1,2，董 蕊1，范 超1，張 晶2,*

（1.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2. 長春科技學院醫學院，吉林 長春 130061）

將10 個蜂王漿樣品貯藏在不同溫度（室溫、4、-20、-80 ℃）和時間（15、45、65、80 d）條件下，采用高效液相色譜法檢測其5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）、10-羥基-2-癸烯酸（1 0-hydroxy-2-decanoic acid，10-HDA）和精氨酸雙糖苷（arginyl fructosyl glucose，AFG）含量的變化。結果表明，蜂王漿樣品中10-HDA的含量穩定，不隨貯藏溫度和時間的變化而變化；5-HMF和AFG的含量隨貯藏溫度升高及時間的延長而增加。因此5-HMF和AFG可作為衡量蜂王漿新鮮程度的指標性成分，而10-HDA不可以作為此標準。但10-HDA是蜂王漿中特有成分，其含量高低會直接影響蜂王漿的功效，故5-HMF、AFG與10-HDA三者結合對蜂王漿的品質進行評價會更加準確。

蜂王漿；5-羥甲基糠醛；10-羥基-2-癸烯酸；精氨酸雙糖苷；品質評價

蜂王漿又稱王漿、蜂乳、蜂皇漿，工蜂舌腺和上鄂腺分泌的乳狀物質[1]。蜂王漿具有很高的營養價值，并具有顯著的抗衰老[2]、抗菌消炎[3]、抗腫瘤[4]等藥理作用，是藥食同源的天然物質。我國是蜂王漿出口和生產的大國，世界上90%的蜂王漿產自中國，因此控制蜂王漿的質量具有重要的意義。

目前，評價蜂王漿質量的指標性成分有10-羥基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decanoic acid，10-HDA）[1]、糠氨酸[5]、泛酸[6]、水溶性蛋白[7]，另外，通過蜂王漿的黏度變化和顏色變化[6]也可以判斷蜂王漿的質量。10-HDA是國家標準唯一規定需進行限量檢測的指標性成分，含量大于1.4%為合格品[1]，但其作為衡量蜂王漿新鮮度的指標則未見報道。

食品在貯藏過程中會發生褐變，導致食品營養成分流失，品質下降。褐變分為酶促褐變和非酶褐變，非酶褐變包括美拉德反應、抗壞血酸氧化分解、焦糖化作用、酚類物質的縮合反應4 種反應機制[8]，其中美拉德反應主要是含氨基化合物與含羰基化合物之間的反應。蜂王漿中富含蛋白質、氨基酸及糖類化合物，在貯藏過程易發生美拉德反應。美拉德反應主要分為3 個階段[9]，初級階段，游離的氨基和游離的羥基發生縮合形成不穩定的亞胺衍生物，在酸性條件下發生Amadori分子重排，另外若反應物為酮糖可能發生Heyenes分子重排，此階段各反應歷程均可逆；中間階段有3種途徑，第1條途徑為若反應體系為酸性則發生1,2-烯醇化反應，最終形成羥基糠醛，第2條途徑為在堿性條件下1,2-烯醇化反應，形成還原酮類和二羰基化合物，第3條途徑發生Strecker反應，風味產物在此過程中形成；最終階段包括兩類反應，一類為醇醛縮合反應形成更高級別的不飽和醛，另一類反應為聚合反應，形成復雜的高分子色素類黑精。

5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）是食品和中藥中常見的美拉德反應產物[10]，該物質穩定性欠佳，可進一步分解為乙酰丙酸和甲酸或是聚合[11]。5-HMF對人體橫紋肌和內臟有毒副作用，能產生一定程度的基因毒性[12]，1%的5-HMF可能引發ACF（結腸小囊異常生長）[13]。因此，5-HMF含量檢測被廣泛用于評價食品和中藥的質量[14-16]。故對蜂王漿貯藏過程中5-HMF含量變化進行分析是十分必要的。

精氨酸雙糖苷（arginyl fructosyl glucose，AFG）最初發現于紅參中[17]，是麥芽糖與精氨酸經加熱后，在美拉德反應的初始階段，酸性條件下發生Amadori分子重排而得到的產物。研究[18-20]表明，AFG在抗氧化、抗糖尿病、增強免疫力、擴張血管以及促進微循環等方面有著顯著效果，隨著美拉德反應的進行，AFG的含量不斷增加[21]，目前，還未見文獻報道其在食品和藥品質量評價中的應用。蜂王漿中富含精氨酸、葡萄糖、果糖等成分，其中是否含有或者產生AFG，AFG含量能否作為評價蜂王漿新鮮度的指標性成分值得探究。

本實驗采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對不同貯藏溫度和時間的蜂王漿中10-HAD、5-HMF和AFG含量進行測定，以期為建立蜂王漿品質評價體系及蜂王漿的質量控制標準提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

10 個蜂王漿樣品，購自知名蜂產品公司，生產日期均為2013年或2014年。各產品進行分裝，分別貯藏在室溫和4、-20、-80 ℃條件下，貯藏時間分別為15～80 d。具體樣品標記為WJ-1～WJ-10，產地及編號見表1。

表1 蜂王漿樣品Table 1 Information about royal jelly samples

1.2 儀器與試劑

LC-20AT HPLC儀（紫外檢測器、LC solution 工作站） 日本島津公司；SZ-93自動雙重純水蒸餾器上海亞榮生化儀器廠；分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HC-2517高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；0.45 μm微孔濾膜 上海興亞凈化材料廠；1 mL注射器 曙光健士醫療器械集團有限公司。

甲醇、乙腈（色譜純） 美國Fisher Scientific公司；10-HDA標品（≥98%） 上海超研生物科技有限公司；5-HMF標品（≥98%） 上海研晶生化試劑有限公司；AFG標品（實驗室自制，HPLC檢測≥98%）。

1.3 方法

1.3.1 10-HDA的含量分析

1.3.1.1 10-HDA對照品溶液制備

稱取10-HDA對照品1.000 mg于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，得0.01 mg/mL的標準品溶液。過0.45 μm微孔濾膜，備用。

1.3.1.2 10-HDA供試品溶液制備

精密稱取1.000 g蜂王漿，無水乙醇定容至10 mL，室溫條件下超聲30 min，取出，6 000 r/min離心10 min，取上清液，并稀釋，制成質量濃度為1 mg/mL的樣品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

1.3.1.3 10-HDA的HPLC分析條件

采用Nucleosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫為30 ℃，以乙腈-水（27∶73，V/V）為流動相，等度洗脫，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長210 nm。

1.3.2 5-HMF的含量分析

1.3.2.1 5-HMF對照品溶液制備

精密稱取5-HMF對照品1.000 mg，甲醇定容至10 mL的容量瓶中，制成質量濃度0.1 mg/mL的對照品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

1.3.2.2 5-HMF供試品溶液制備

取蜂王漿1.000 g，用10 mL的水溶解，Sevag法除蛋白[22]，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

1.3.2.3 5-HMF的HPLC分析條件

采用Nucleosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫為30 ℃，以甲醇-水-冰醋酸（10∶89∶1，V/V）為流動相，等度洗脫，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長285 nm。

1.3.3 AFG的含量分析

1.3.3.1 衍生溶液配制

制備三乙胺-乙腈溶液：精密取三乙胺1.4 mL，加入乙腈8.6 mL，混勻，冷藏保存；制備異硫氰酸苯酯-乙腈溶液：精密取異硫氰酸苯酯25 μL，加乙腈2 mL，混勻，冷藏保存[23]。

1.3.3.2 AFG對照品溶液制備

精密稱取AFG標對照品0.500 mg，去離子水定容至5 mL，制成0.5 mg/mL的對照品溶液，取1 mL置于2 mL離心管中，加入三乙胺-乙腈溶液100 μL，異硫氰酸苯酯-乙腈溶液 50 μL，混勻，室溫放置1 h，然后加入正己烷 400 μL，振搖后放置 10 min，取下層溶液，0.45 μm濾膜過濾，備用。

1.3.3.3 AFG供試品溶液制備

取1.000 g的蜂王漿溶液將其溶于10 mL的無水乙醇，30 ℃超聲15 min中，6 000 r/min離心10 min，去除上清液，室溫放置，將無水乙醇自然揮凈，將殘渣溶于20 mL水中，30 ℃超聲30 min，6 000 r/min離心10 min，取上清液，將所得溶液質量濃度稀釋至50 mg/mL，取1 mL 置于2 mL離心管中，按對照品同法衍生。

1.3.3.4 AFG的HPLC分析條件

選用V e n u s i l-A A氨基酸分析專用柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為40 ℃；流動相A為乙酸鈉緩沖溶液（準確稱取7.6 g乙酸鈉，加入925 mL去離子水，混勻后加入2～3 滴冰乙酸和2 mL的磷酸，混勻后加乙腈70 mL，混勻）；B相為80%的乙腈，梯度洗脫程序：0～4 min：0%～3% B；4～16 min：3%～10% B；16～20 min：10%～20% B；20～40 min，20%～100% B，流速1 mL/min，檢測波長254 nm[23]。

2 結果與分析

2.1 色譜條件確定

精密稱取蜂王漿樣品和10-HAD、5-HMF和AFG 3種成分的對照品，分別按照1.3節方法制備得空白的供試品溶液和對照品溶液，按照2010版藥典規定方法[24]，分別對3 種成分的分析方法進行方法學考察結果表明，方法精密度、重復性和穩定性良好，加樣回收率分別為99.1%、99.0%、98.9%；相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值分別為1.4%、1.3%、1.3%，見表2。10-HAD、5-HMF和AFG的HPLC圖譜見圖1～3。

表2 3種成分的線性關系、精密度、穩定性、重復性和回收率Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients,precision, stability, reproducibility and recoveries of the HPLC methodfor determination of 10-HAD, 5-HMF and AFG

圖1 10-HDA的HPLC譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 10-HDA

圖2 5-HMF的HPLC譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 5-HMF

圖3 AFG的HPLC譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of AFG

2.2 樣品測定結果

分別取蜂王漿樣品，精密稱定，按1.3.1節分別制備供試品溶液，測定并計算含量，結果見圖4和表3。

圖4 不同貯藏條件下蜂王漿樣品中10-HDAA（aa1、aa2）、55--HHMMFF（bb1、bb2）和AAFFGG（cc1、cc2）含量的變化Fig.4 Changes in the contents of 10-had (a1, a2), 5-HMF (b1, b2), and AFG (c1,c2) in royal jelly under different storage conditions

通過圖4a可知，同一蜂王漿樣品中的10-HDA的含量在不同貯藏溫度條件下，其含量基本接近，也沒有隨貯藏時間延長而增加，可以說明10-HDA性質穩定，不會隨貯藏條件變化而發生含量的變化。

圖4b、c結果顯示，當貯藏時間相同時，5-HMF和AFG的含量隨著貯藏溫度的升高而增大。當貯藏溫度相同時，隨著貯藏時間延長，蜂王漿樣品中的5-HMF和AFG的含量升高。隨著貯藏時間的延長，不同貯藏溫度條件下的蜂王漿樣品中5-HMF和AFG 的含量升高速度為：室溫＞4 ℃＞-20 ℃＞-80 ℃。另外，對從超市買的新鮮蜂王漿進行測定，發現新鮮的蜂王漿中不含有5-HMF，AFG的含量在37.3～173.3 mg/g的范圍內。文獻[25]報道，在室溫條件下貯藏10 d左右的蜂王漿會喪失大部分活性，對5-HMF、AFG含量進行測定都有增長，結果見表3。通過對比分析發現，室溫貯藏10 d的蜂王漿中AFG含量與4 ℃貯藏65 d的蜂王漿中AFG含量接近。

表3 10種新鮮蜂王漿樣品及其室溫貯藏10d后5-HMF和AFG的含量比較Table 3 Comparison of the contents of 5-HMF and AFG in 10 freshroyal jelly samples and those stored for 10 days at room temperature

3 討 論

本實驗通過對不同貯藏條件下的蜂王漿樣品中的10-HDA、5-HMF和AFG含量進行分析，結果表明，10-HDA不隨貯藏時間延長和溫度升高而發生規律性變化，這一結論與董彩霞等[26]研究結果一致，可見10-HDA的性質穩定，不適合作為評價蜂王漿新鮮程度的指標性成分，但因10-HDA是蜂王漿的特有成分，其有顯著的藥理作用，如保肝作用[27]、抗腫瘤作用[28]，含量高低會直接影響蜂王漿的功效，故10-HDA可用于鑒別蜂王漿及評價其質量。

本研究發現，在新鮮的蜂王漿中未檢測到5-HMF，但AFG的含量較高，二者的含量均隨貯藏時間的延長或溫度的升高明顯增加，且其含量變化規律明顯。同時，伴隨二者含量的增加，蜂王漿樣品的顏色變深且渾濁，可見，5-HMF和AFG的含量可以標示出蜂王漿的新鮮程度。所以，用5-HMF和AFG作為指標性成分評價蜂王漿的新鮮度可行。在鑒定蜂王漿產品品質時，10-HDA、5-HMF和AFG 3 種成分的同時檢測，可對蜂王漿的質量及新鮮度做出較完善的綜合評價。

美拉德反應是蜂王漿貯藏過程中發生的重要反應之一，其產物也較多，除已被認可的5-HMF外，有學者還發現pentodilysine和羧甲基賴氨酸[29]，但此2 種成分在蜂王漿中的含量都極低，檢測靈敏度要求高，且其在低溫條件下含量變化不明顯。AFG的含量在蜂王漿中的含量較高，即使在-20 ℃條件下，且隨貯藏時間的變化也非常明顯，因此更適合作為評價蜂王漿新鮮度的指標性成分。蜂王漿中含有多種氨基酸和糖類成分[30-31]，其美拉德反應產物很復雜，蜂王漿中是否還存在其他美拉德產物可用來評價蜂王漿品質，還有待進一步的考究。

本實驗發現在蜂王漿中含有AFG，并提出AFG可做為指標性成分評價蜂王漿的品質，不僅為蜂王漿的品質評價提出新的指標性成分。同時，AFG具有多種藥理活性，目前市場上已有以AFG為主要成分的化妝品。因蜂王漿中AFG含量較高，且隨著貯藏時間延長，溫度升高，其含量會不斷升高，此也為蜂王漿的進一步開發利用提供了新思路。

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Changes in the Contents of 5-HMF, 10-HDA and AFG in Royal Jelly during Storage

WANG Lulu1,2, DONG Rui1, FAN Chao1, ZHANG Jing2,*
(1. College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. College of Pharmacy, Changchun University of Science and Technology, Changchun 130061, China)

This study examined the effects of different storage temperatures and storage times on the contents of 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF), 10-hydroxy-2-decanoic acid (10-HDA) and arginyl fructosyl glucose (AFG) in 10 royal jelly samples by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that the content of 10-HDA was stable and did not change with storage temperature and time. However, the contents of 5-HMF and AFG in royal jelly were increased with increasing storage temperature and prolonging storage time. Thus, 5-HMF and AFG but not 10-HDA can be used as indicators to evaluate the freshness of royal jelly. In addition, 10-HDA was the endemic component in royal jelly, and its content directly influenced the health benefits of royal jelly. Therefore, the combination of 5-HMF, 10-HAD and AFG enables accurate evaluation of the quality of royal jelly.

royal jelly; 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF); 10-hy droxy-2-decanoic acid (10-HDA); AFG; quality evaluation

10.7506/spkx1002-6630-201602048

R932

A

1002-6630（2016）02-0271-05

王露露, 董蕊, 范超, 等. 蜂王漿在貯藏過程中5-羥甲基糠醛、10-羥基-2-癸烯酸及精氨酸雙糖苷含量的變化[J]. 食品科學, 2016, 37(2): 271-275. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602048. http://www.spkx.net.cn

WANG Lulu, DONG Rui, FAN Chao, et al. Changes in the contents of 5-HMF, 10-HDA and AFG in royal jelly during storage[J]. Food Science, 2016, 37(2): 271-275. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602048. http://www.spkx.net.cn

2015-03-31

吉林省科技發展計劃項目（20120236）

王露露（1990—），女，碩士研究生，研究方向為天然產物化學。E-mail：relulu@126.com

*通信作者：張晶（1971—），女，教授，博士，研究方向為天然產物化學。E-mail：zhjing0701@163.com