多重熒光定量PCR測定瘧原蟲方法建立

何曉翔+雷永良+王曉光+傅圣勇++劉敏

[摘要] 目的 建立可同時檢測四種瘧原蟲的多重熒光定量PCR方法。 方法 PCR擴增四種瘧原蟲目的片段，克隆并構建標準質粒，進行梯度稀釋。體系按濃度加入五重引物探針，對臨床四種瘧原蟲陽性血樣及單一腺病毒和肺炎支原體陽性血樣、人基因組進行特異性檢測。將本地區優勢蟲種惡性瘧及間日瘧陽性血樣混合并檢測。每個反應做一式三份驗證重復性。檢測標準品梯度濃度，獲得體系最低檢測限。 結果 成功構建四種瘧原蟲標準質粒。對20份樣本進行檢測，其中15份惡性瘧，3份間日瘧，1份三日瘧，1份卵形瘧，與原有確證結果一致。對單一腺病毒及肺炎支原體陽性血樣、人基因組檢測結果均為陰性。惡性瘧及間日瘧陽性血樣混合檢測顯示3條特異性擴增曲線。三個復孔的變異系數在0.17～4.96之間。惡性瘧可檢測到102 copies/mL，間日瘧、三日瘧、卵形瘧可檢測到103 copies/mL。 結論 建立五重熒光定量PCR檢測四種瘧原蟲特異性及重復性均較好，靈敏度高，可用于瘧原蟲快速篩選及分型鑒定。

[關鍵詞] 多重熒光定量PCR；瘧原蟲；蚊傳染??；瘧疾

[中圖分類號] R440 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）23-0004-03

[Abstract] Objective To establish the multiple fluorescence quantitative PCR measure to detect four types of plasmodium at the same time. Methods Target fragments of four types of plasmodium were extended by PCR， the standard plasmid was cloned， constructed and diluted by gradient. Five primers and probes were added into the system according to the concentration and the clinical four plasmodium positive blood sample， single adenovirus and mycoplasma pneumonia positive blood sample as well as human gene was detected specifically. The falciparum malaria and tertian malaria positive blood sample caused by the local superior plasmodium were mixed and detected. Each experiment was performed for three times to validate the repetitiveness. The gradient concentration of the sample was detected and the lowest detection limitation was achieved. Results The standard plasmids of four plasmodiums were successfully constructed and 20 samples were detected. 15 samples were falciparum malaria and 3 samples were tertian malaria， 1 sample was quartan malaria and 1 sample was ovale malaria， which was in accordance with the original validated results. The results of detection of single adnovirus and mycoplasma pneumonia positive blood sample and human gene were negative. 3 specifically extended curves were presented by the mixed detection of falciparum malaria and tertian malaria positive blood sample. The variable coefficients of the three duplication holes were within 0.17-4.96. Falciparum malaria was detected to be 102 copies/mL and tertian malaria， quartan malaria as well as ovale malaria was detected to be 103 copies/mL. Conclusion The established five fluorescence quantitative-PCR in the detection of four types of plasmodium has good specificity and repetitiveness as well as high sensitivity， which can be used in the quick screening and type identification of plasmodium.

[Key words] Multiple fluorescence quantitative-PCR； Plasmodium； Mosquito-borne diseases； Malaria

瘧疾是由蚊子傳播的一種寄生蟲病，由帶有瘧原蟲的雌性按蚊叮咬人體而傳染，其已經成為全球熱帶、亞熱帶最嚴重的公共衛生問題之一[1]。瘧疾主要有四種致病瘧原蟲：惡性瘧（falciparum）、間日瘧（vivax）、卵形瘧（ovale）、三日瘧（malariae）。隨著我國對外開放程度的不斷擴大，從瘧疾流行區歸來后引起瘧疾爆發的報道次數逐漸增多，且近年來輸入性病例所占比例不斷增加[2]，各個省份均有報道，故對瘧疾的控制計劃是巨大的挑戰。

臨床瘧疾診斷和最常規的方法以鏡檢瘧原蟲、臨床體征觀察、抗原檢測為主。但其準確性、靈敏度均有待提高。PCR檢測外周血寄生蟲的敏感性和特異性較好，且PCR方法在分型鑒定中有特殊優勢。目前，PCR鑒定瘧原蟲方法大致有：巢氏PCR[3，4]、一步法單管多重PCR[5]、熒光PCR（SYBR Green）[6]、環介導等溫擴增PCR（LAMP）。其中巢氏PCR擴增樣本之后需要核酸膠鑒定[7]，溶解曲線判斷要求不同種瘧原蟲的溶解溫度差異要大。本研究旨在開發操作更簡單、單步驟的多重PCR體系，在單管中能同時鑒定幾種瘧原蟲的方法，現報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

四種瘧原蟲陽性血樣來自臨床患者，病例收集時間為2014年3月1日～2016年3月1日，由本地疾控中心經金標、鏡檢、核酸檢測等方式確診[8]；腺病毒、肺炎支原體臨床陽性血樣，人基因組DNA由本實驗室保存。7500熒光定量PCR儀購自ABI公司，QIAamp DNA Blood Mini Kit（德國qiagen）購自杭州怡丹生物技術有限公司，NanoDrop分光光度計購自賽默飛世爾科技。Premix Ex Taq、T載體購自takara。割膠回收試劑盒購自Promega公司。Taq酶購自全式金公司。TG1菌株由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 標準質粒構建 四種瘧原蟲陽性血樣提核酸DNA，使用通用上下游引物（表1），Taq酶PCR擴增見試劑說明書，溫度：94℃ 2 min。94°C 30 s，61°C 30 s，72℃ 1 min，35個循環，72°C 10 min。使用試劑盒純化PCR產物，克隆到pMD19-T載體。轉化E.coli TG1感受態細胞，在藍白斑上挑取白斑。提質粒DNA[9]，測序驗證，使用分光光度計測定濃度并按公式計算拷貝數[10]，進行梯度倍比稀釋。

1.2.2 特異性及重復性檢測 ①對四種瘧原蟲陽性血樣共20份樣本進行多重熒光定量PCR檢測，體系引物探針用量見表1。25 μL總體積，10 μL混合液，模板4 μL。95℃ 30 s，1個循環；95℃ 5 s，58℃ 34 s，40個循環；60℃搜集熒光信號。質量控制：加入腺病毒、肺炎支原體陽性血樣DNA，人基因組DNA。②將惡性瘧與間日瘧陽性血樣混合在一管中，使用自建體系檢測，比較特異性。對同一反應做三個復孔，計算均數、標準差及變異系數，比較重復性。

1.2.3 靈敏度檢測 標準品質粒濃度梯度為10、102、103、104、105、106、107 copies/mL，檢測最低檢測限[11]。

2結果

2.1特異性

PCR結果顯示40條特異擴增的S型曲線，通用FAM熒光標記20條典型S型曲線，15份樣本HEX熒光基團標記為惡性瘧，3份CY5標記為間日瘧，1份ROX三日瘧，1份CY3卵形瘧，腺病毒及肺炎支原體陽性血樣、人基因組樣本檢測均未見特異性擴增。以上所有樣本均與預期結果符合?；旌涎獦訕颖緳z測顯示FAM、HEX、CY5

2.2重復性

2.3 靈敏度

經測序，成功構建四種瘧原蟲標準質粒，四個標準曲線的R2均>0.993，各稀釋度曲線相關性好，惡性瘧的為最低檢測限為102 copies/mL，間日瘧、三日瘧、卵形瘧均為103 copies/mL。

3討論

多重熒光定量PCR技術由實時熒光PCR發展而來，通過幾種不同的探針熒光報告基團混合，能同時檢測基因序列不同的病原體，在國內外蓬勃發展[12-14]。傳統PCR技術檢測瘧原蟲需要經過多輪擴增或使用多對引物同時擴增才能鑒別，凝膠電泳費時且難以自動化。本實驗旨在單管一步反應獲得直觀結果，簡化實驗步驟。

我國瘧疾消除計劃初顯成效，近年來病例多為輸入性感染，大量用藥導致耐藥發生，檢測瘧原蟲隱蔽性及困難程度增加。鏡檢診斷瘧原蟲對技術人員專業要求高，且容易漏診。部分地區實驗室鏡檢技術力量薄弱，一線醫技人員對疫情不能及時檢驗[15]，PCR快速檢測在出入境關口能克服顯微鏡的限制，陽性檢出率高[16，17]，且不受耐藥寄生蟲影響，應用廣泛[18]。我市患者多為惡性瘧或間日瘧感染，快速準確鑒別蟲種對合理治療有重大意義。

目前國外學者Phuong M等[19]針對地區優勢瘧原蟲種類設計兩、三重熒光探針，不能同時鑒定四種瘧原蟲。國內學者黃雨婷[7]、李美等[20]檢測四種瘧原蟲，巢氏引物擴增后經核酸膠鑒定蟲種，曲線的Tm值集中，不易區分和鑒別蟲種。

本實驗通過對以上方法的綜合和優化，調整反應條件、濃度、熒光探針，建立單管中能同時檢測四種瘧原蟲的多重PCR探針系統。本實驗方法操作簡單，從提取DNA到讀出結果在3 h內完成，該系統可對除wallikeri亞種之外的瘧原蟲進行分型，但瘧原蟲屬保守18S小亞基核糖體基因設計的通用上下游引物可檢測出所有瘧原蟲病原體，以此可應對瘧原蟲多個基因型差異[21]。本研究的20份樣本均已確診，使用自建方法得出預期結果，通過反應可區分出四種瘧原蟲?；旌涎獦又屑尤肴嘶蚪M，可測得通用、惡性、間日瘧特異性擴增，應對混合感染[22]。三個復孔檢測曲線呈高度相關性，變異系數<5。對質粒標準品倍比稀釋的梯度濃度進行檢測，結果顯示較好的相關性。四種瘧原蟲最低檢測限均<103 copies/mL，惡性瘧可達102 copies/mL，該靈敏度優于其他方法，且有利于混合感染的檢測，進一步滿足日常檢測工作需要。在靈敏度與重復性檢測中，梯度濃度相關曲線系數R2>0.98，表明標準品定量可靠。PCR操作過程中需注意污染，且由于本體系引物探針眾多，需保證序列質量及保存恰當。為了最大限度獲得特異性擴增，本實驗優化反應條件及體系濃度，增加特異性及敏感性。上述檢測結果顯示自建方法高靈敏度、特異性和穩定性，適合在出入境、檢驗檢疫等部門推廣應用。

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（收稿日期：2016-04-19）