高溫介導N基因對TMV免疫喪失的代謝輪廓分析

劉旭，王耀峰，余廣宏，宋玉川，王杰，申莉莉，王鳳龍，楊金廣

1 中國農業科學院煙草研究所煙草行業煙草病蟲害監測與綜合治理重點開放實驗室,山東青島 266101；2 中國農業科學院研究生院,北京 100081；3 甘肅省煙草公司慶陽市公司,西峰 745000；4云南香料煙有限責任公司,保山 678000

生物技術

高溫介導N基因對TMV免疫喪失的代謝輪廓分析

劉旭1,2，王耀峰3，余廣宏4，宋玉川4，王杰1，申莉莉1，王鳳龍1，楊金廣1

1 中國農業科學院煙草研究所煙草行業煙草病蟲害監測與綜合治理重點開放實驗室,山東青島 266101；2 中國農業科學院研究生院,北京 100081；3 甘肅省煙草公司慶陽市公司,西峰 745000；4云南香料煙有限責任公司,保山 678000

高溫（＞28℃）可引起含N基因的免疫寄主對TMV抗性喪失,導致TMV系統侵染。本研究以枯斑三生（Nicotiana tabacumvar. Samsun NN) 煙草為研究材料,采用代謝組學方法,系統研究25℃和31℃條件下,TMV未侵染和TMV侵染12 h、24 h和48 h枯斑三生煙草的代謝差異。應用氣相色譜與質譜聯用（GC-MS）技術,結合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘-判別分析法（OPLS-DA）對不同溫度下代謝產物的差異性進行分析。結果表明：GC-MS技術共檢測到49種代謝物包括氨基酸類、糖類、有機酸類、脂肪酸類、醇類以及多胺類等。在25℃常溫條件下,TMV侵染枯斑三生煙引起蘋果酸、水楊酸、γ -氨基丁酸、脯氨酸和乙醇胺等代謝物含量上調,而在31℃高溫處理N基因失活后,TMV侵染導致組織蔗糖和肌醇含量下調、葡萄糖和果糖含量上調以及伴隨氨基酸類含量普遍上調。

TMV；代謝；N基因

在植物與病蟲害相互作用、長期協同進化過程中,植物為了抵御病蟲害的侵襲,常依賴其自身的天然免疫來抵御有害生物侵襲,并形成了完善的免疫機制。煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）與具有N基因寄主的互作是最早也是研究最多的植物—病原菌互作的模型之一[1]。寄主的抗性基因N基因與TMV復制酶中的p50能夠特異性識別并產生過敏性壞死反應（HR-PCD）,從而將TMV限制在侵染位點內形成枯斑[2]。N基因編碼蛋白的TIR、NBS、LRR 結構域可識別TMV配體的蛋白復合物,激發信號傳導途徑誘導防御反應[3]。Kiraly 等研究表明高溫導致含有N基因的寄主NADPH氧化酶和過氧化物酶的降低,從而導致寄主對TMV免疫的減弱[4]。N基因具有溫度敏感性,當環境溫度高于28℃,TMV侵染含有N基因的煙草,植物失去發生過敏反應（HR）的能力,導致TMV在系統中擴散侵染[5]。因此,N基因對于TMV侵染引起的病害的防治是一把雙刃劍,環境溫度的驟變,特別是全球溫度的升高和我國西南煙區的持續高溫干旱,使種植含有N基因的烤煙品種系統性壞死病害趨于嚴重,甚至造成煙葉絕產。

在植物機體中,代謝產物是細胞調控過程的終產物,其種類和數量的變化是生物系統對環境（生物或非生物脅迫）或基因修飾的最終響應[6]。而代謝組學正是對細胞或者組織內所有代謝產物進行定性的定量研究的一門科學[7-8]。因此,比較感病植株與對照植株的代謝輪廓差異,是一個解開多因素參與的生化途徑的強大工具[9-10]。已有的研究大多集中在研究TMV侵染煙草所引起的代謝差異,但是對于在抗性品種中溫度和時間綜合影響代謝物變化的研究較少。

本研究以TMV和含有N基因的枯斑三生煙（Nicotiana tabacumcv. Samsun)為研究材料,分析TMV侵染枯斑三生煙在不同溫度條件下（25℃和31℃）代謝產物的差異,在個體水平上探討不同溫度條件下對TMV侵染枯斑三生煙應答的代謝輪廓,結合多元數據分析手段,揭示寄主的天然免疫與TMV致病相關的代謝物和代謝途徑的變化,為探討植物天然免疫的穩定性和病毒的致病機理提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

煙草材料：TMV普通株系（TMV-U1）毒源以及寄主材料枯斑三生煙均為中國農業科學院煙草研究所保存。

主要試劑和儀器：核糖醇、N-甲基三甲基硅基三氟乙酰均購自上海TCI化成工業發展有限公司；甲氧基胺鹽酸鹽購于成都西亞化工股份有限公司；正十八烷購自上海江萊生物科技有限公司；甲醇、氯仿、吡啶均為分析純,購于上海國藥化學試劑有限公司；恒溫混勻儀購自杭州奧盛儀器有限公司；Agilent 7890A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀購自Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙草生長條件,病毒侵染和取樣

在室溫下,將枯斑三生煙種子在25 cm×15 cm的育苗盤內育苗,待煙苗長至3片真葉時,將其假植在50孔聚乙烯塑料盤（55 cm×28 cm,圓錐形孔上部直徑5 cm,孔高5 cm）內,當煙苗長至4片真葉時,移栽于直徑10 cm的花盆內。將煙苗分為兩組,分別放入25℃和31℃的光照培養箱內,待長至7葉期時用于試驗。

采用摩擦接種法,取TMV毒源新鮮病葉按照（1:40）與滅菌后的0.1 mol/L的PBS緩沖液混合置于滅菌的研缽中,研磨成勻漿,滅菌紗布過濾為接種液,輕輕摩擦接種葉片上,接種后無菌水洗去葉片上的殘留液,將煙株置于14 h光周期的光照培養箱。

選取長勢基本一致的煙株,以不接種TMV取樣作為對照,分別在接種后12 h、24 h、48 h取樣,每組6個重復,各個時間點的取樣部位分別一致。用滅菌后的剪刀迅速剪取葉基部,將樣品用錫箔紙包裹迅速置于液氮中,在處理之前于-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2 煙草代謝產物的提取

代謝產物的提取方法按照Jan等[11],方法略有修改。用液氮在研缽中研磨煙草葉片；加入1 mL甲醇（-20℃預冷）,繼續研磨片刻；將植物勻漿裝入2.0 mL離心管中,再加入甲醇直至1.4 mL,渦旋10 s；加入60 μL核糖醇,渦旋10 s；70℃,230 rpm,混搖15 min；12000 g,離心10 min；轉移上層液加入750 μL氯仿（-20℃預冷）,加入1.5 mL去離子水,渦旋10 s；2200 g,離心15 min；取上層液,在真空濃縮儀中濃縮；加入40 μL鮮制的甲氧基胺鹽酸鹽溶液,37℃ 250 rpm振蕩120 min；加入70 μLN-甲基三甲基硅基三氟乙酰溶液；37℃ 250 rpm振蕩30 min；轉入GC-MS玻璃小瓶；待進一步進行GC-MS分析。

1.2.3 GC/MS分析

毛細管色譜柱為Agilent J&W Scienti fi c公司的HP -5ms （30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）。儀器參數設定為進樣口溫度280℃,EI離子源溫度為230℃,四級桿溫度為150℃,高純氮氣（純度大于99.999%）作為載氣,載氣流速為6 mL/min,不分流進樣,進樣量為1 μL。升溫程序為：初始溫度70℃,維持2 min,6℃/min的速度升至160℃,再以10℃/min的速度升至240℃,最后以20℃/min的速度升至300℃并維持6 min。采用全掃描模式進行質譜檢測,質譜檢測范圍為50～600（m/z）。采用隨機順序進行連續樣本分析,避免因儀器信號波動而造成的影響。

1.2.4 數據處理

在R軟件平臺下采用自寫的程序代碼進行數據預處理,包括基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和質譜碎片歸屬分析,最后在EXCEL2010軟件中進行后期編輯,包括來自于柱流失和樣本制備造成的雜質峰的剔除和定量離子選擇等,將最終結果組織為二維數據矩陣,包括變量（rt-mz,即保留時間-質荷比）、觀察量（樣本）和積分面積。然后將所有數據歸一化到總信號積分。對代謝物信息進行中心化和歸一化（Par）處理后,將數據矩陣導入Simca-P軟件（版本12.0）,分別進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘方判別分析（OPLS-DA）。應用DPS軟件對差異性代謝物矩陣進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 GC-MS檢測代謝物的鑒定

對不同溫度和不同侵染時期的48個煙草葉片樣品進行GC-MS衍生化分析,得到樣品的總離子流圖如圖1所示,采用AMDIS軟件的默認參數對樣本的原始儀器數據文件進行反卷積分析,單次分析共檢測到117種代謝物,搜索自建的標準物質數據庫（42種植物中常見的糖類、醇類、氨基酸類和酸類物質）和NIST商業數據庫,初步定性了49種化合物,包含13種氨基酸（蘇氨酸、γ-氨基丁酸、異亮氨酸、賴氨酸、丙氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺）,13種糖類（景天庚酮糖、D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、β-龍膽二糖、D-(+)-海藻糖、6-磷酸果糖、6-磷酸葡糖、麥芽糖、核糖、鼠李糖、阿洛糖、D-(-)-赤蘚糖）,9種有機酸（蘋果酸、甘油酸、葡糖酸、酒石酸、延胡索酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、莽草酸、水楊酸）,4種醇類（山梨糖醇、赤蘚糖醇、菜油甾醇、木糖醇）,3種脂肪酸（硬脂酸、α-亞麻酸、肉豆蔻酸）,以及7種其他類物質（棕櫚酰胺、琥珀酰酐、肌醇、煙酸、脫氫抗壞血酸、維生素E、乙醇胺）。

圖1 提取代謝物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of metabolites

2.2 不同溫度下TMV侵染枯斑三生煙引起的代謝差異

利用Simca-P軟件分別對25℃和31℃條件下,TMV未侵染（TMV-free）和TMV侵染后12 h、24 h、48 h的樣品數據進行主成分分析。圖2所示模型前兩個主成分累積解釋率R2X=0.617,圖3所示模型累積解釋率R2X=0.622,都能較好的解釋不同處理結果之間的差異性,且分散度較好。PCA圖顯示,在25℃和31℃條件下,TMV-free和TMV侵染12 h、24 h、48 h后代謝物存在明顯變化。

圖2 25℃下TMV未侵染和不同侵染時間點樣品的PCA得分圖Fig. 2 PCA scores plots of TMV-free and TMV infected samples at different time at 25℃

圖3 31℃下TMV未侵染和不同侵染時間的PCA得分圖Fig.3 PCA scores plots of TMV-free and TMV infected samples at different time at 31℃

2.3 不同溫度下TMV侵染枯斑三生煙差異性代謝物的變化

對GC-MS數據進行OPLS-DA分析。圖4顯示,在25℃條件下與對照（TMV-free）相比,TMV侵染后12 h、24 h、48 h的模型累積解釋率分別為0.665、0.831、0.898,得分率分別為0.92、0.972、0.972,模型可靠。提取OPLS-DA模型中VIP＞1的物質變量,這些物質在載荷圖中距原點距離較大,說明這些物質在TMV侵染后12 h、24 h、48 h后代謝途徑有了較大的變化。由表1可知,與對照相比,TMV侵染后12 h引起蔗糖、甘油酸、肌醇含量的顯著下調,糖類（葡萄糖和果糖）、有機酸類（蘋果酸和水楊酸）、氨基酸類（γ-氨基丁酸GABA和脯氨酸）以及肌醇與乙醇胺含量的顯著上調； TMV侵染24 h與12 h變化基本相同,而在24 h葡萄糖和肌醇未發生顯著變化,同時延胡索酸的含量顯著下調；TMV侵染48 h,蔗糖、甘油酸、延胡索酸、肌醇含量的顯著下調,同時果糖和核糖、蘋果酸和水楊酸、GABA與乙醇胺含量的顯著上調。

圖4 25℃條件下各個侵染時間點的OPLS-DA荷載圖Fig. 4 Loading plots of each infection time by OPLS-DA at 25℃

表1 25℃條件下侵染各時間點差異性代謝物的變化Tab.1 Changes of metabolites at different infection time at 25℃

圖5顯示在31℃條件下,各侵染時間點與對照相比的差異性代謝物。TMV侵染后12 h、24 h、48 h的模型累積解釋率分別為0.779、0.848、0.894,得分率分別為0.987、0.983、0.993。表2顯示,與對照相比,TMV侵染12 h,蔗糖、甘油酸、天冬氨酸、GABA、肌醇含量顯著下調,糖類（葡萄糖、果糖和核糖）、蘋果酸、纈氨酸、脯氨酸與硬脂酸含量顯著上調；TMV侵染后24 h,蔗糖、天冬氨酸、乙醇胺、肌醇含量與對照相比顯著下調,而葡萄糖和果糖、蘋果酸和一些氨基酸類（天冬酰胺、GABA、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸）含量則顯著上調；在TMV侵染后48 h,糖類變化與侵染后24 h類似,蘋果酸含量上調、甘油酸含量下調,氨基酸類（GABA、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸）含量顯著上調。

圖5 31℃條件下各個侵染時間點的OPLS-DA荷載圖Fig.5 Loading plots at each infection time by OPLS-DA at 31℃

表2 31℃條件下侵染各時間點差異性代謝物的變化Tab.2 Changes of metabolites at different infection time at 31℃

由兩個溫度下的組內分析可知,糖類的變化基本一致,蔗糖含量下調伴隨果糖和葡萄糖含量上調。有機酸類中蘋果酸含量上調而甘油酸含量下調,在25℃條件下,還伴隨水楊酸含量顯著上調。氨基酸類中GABA和脯氨酸在25℃中都明顯上調,而在31℃中氨基酸類在24 h以后含量普遍上調。肌醇的變化也基本一致,都顯著下調,而乙醇胺在25℃變化明顯為顯著上調。

為了進一步明確在25℃和31℃條件下TMV侵染所造成的代謝差異,進行了組間的OPLS-DA分析。得分圖圖6顯示,模型的累積解釋率為R2X=0.936,第一主成分可以顯著區分不同溫度的代謝差異。圖7對組間各個時間點進行差異物質的篩選和比較,不同溫度下侵染12 h、24 h、48 h的累積解釋率分別為0.819、0.794和0.92。

圖6 25℃和31℃條件下各侵染時間點總OPLS-DA得分圖Fig. 6 OPLS-DA scores plots of samples at different infection time at 25℃ and 31℃

圖7 25℃和31℃條件下各個侵染時間點的OPLS-DA載荷圖Fig. 7 OPLS-DA loading plots at different infection time at 25℃and 31℃

表3 25℃和31℃條件下各侵染時間點差異性化合物的變化Tab.3 Changes of metabolites at different infection time at 25℃ vs 31℃

續表3

表3顯示,31℃條件下對比25℃條件下,侵染12 h時,蔗糖、氨基酸類（天冬氨酸和纈氨酸）、肌醇含量顯著升高,而有機酸類、GABA和脯氨酸顯著下降；侵染24 h時,糖類（蔗糖和果糖）、一些氨基酸類（天冬氨酸、天冬酰胺、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸）、肌醇含量升高,蘋果酸、水楊酸、GABA、脯氨酸含量顯著下降；在侵染48 h時,蔗糖、果糖、天冬氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、肌醇含量顯著升高,而核糖、水楊酸、蘋果酸、GABA、脯氨酸、乙醇胺含量顯著下降。

通過組間比較,在25℃條件下,TMV侵染顯著影響了有機酸類(蘋果酸和水楊酸)、氨基酸類（GABA和脯氨酸）、乙醇胺等物質的代謝。而在31℃條件下,N基因失活后,TMV侵染使糖類（蔗糖、葡萄糖、果糖）、氨基酸類（天冬氨酸、天冬酰胺、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸）、肌醇的變化更為顯著。各個物質在25℃和31℃條件下隨時間的變化情況見表1和表2。

通過組內與組間比較綜合來看,25℃條件下,TMV侵染引起蘋果酸、水楊酸、GABA、脯氨酸和乙醇胺等代謝物含量上調,而31℃條件下即高溫N基因失活后,TMV侵染引起蔗糖和肌醇含量的下調,而果糖、葡萄糖和氨基酸類含量普遍上調。

3 結論與討論

TMV在不同溫度下侵染枯斑三生煙,引起了代謝物質的變化。運用GC-MS技術,結合PCA、OPLS-DA等分析手段,尋找到不同溫度下引起代謝差異的關鍵性物質,并初步分析了其含量變化。分析可知,在N基因正常表達時TMV侵染引起蘋果酸、水楊酸、GABA、脯氨酸和乙醇胺等代謝物含量上調即影響了TCA循環、水楊酸代謝、GABA旁路及多胺類等相關的代謝產物,而在高溫引起N基因失活后,TMV侵染枯斑三生煙表現為蔗糖和肌醇含量的下調,而果糖、葡萄糖和氨基酸類含量普遍上調,即影響了耗能反應的糖代謝、氨基酸代謝和肌醇的變化。

3.1 TMV侵染引起的有機酸類在寄主中的代謝變化

蘋果酸作為三羧酸循環的重要組成部分,在植物代謝中起著重要作用。受到病原菌侵染,組織中蘋果酸會迅速累積,并作為NADP-蘋果酸脫氫酶的底物產生活性氧（reactive oxygen species,ROS）,特別是產生H2O2,這是一種重要的調節分子[12]。H2O2能夠直接殺死病原菌,還可以誘導細胞壁結構蛋白的變化來阻止病菌的侵入[13],并通過激活水楊酸的合成來誘導N基因的表達,產生系統獲得性抗性。寄主通過蔗糖的降解、蘋果酸合成、糖酵解等途徑來保證蘋果酸的積累,增強植株防御反應。表1和表2顯示TMV侵染在兩個溫度下,蘋果酸的含量與對照相比都有積累,而在表3顯示在25℃條件下含量顯著高于31℃,這可能與N基因調控的過敏反應有關。

水楊酸作為重要的信號分子可通過介導寄主過敏反應從而誘導植株產生系統獲得抗性(SAR)。當TMV侵染后,侵染點處水楊酸（SA)含量升高,進而植物其他部位SA含量升高,從而獲得系統抗性[14]。結合表1分析,在25℃的水楊酸含量變化非常明顯,在侵染的48 h內的3個時間段含量依次升高,而在31℃條件下水楊酸的含量沒有發生明顯改變。

甘油酸是光合代謝途徑磷酸甘油酸的前體物質。在25℃和31℃條件下,甘油酸含量都有所下降,推測可能與TMV侵染導致光合作用下降有關。

3.2 TMV侵染引起的GABA旁路的變化

GABA代謝途徑作為三羧酸循環的一個旁路在逆境脅迫中起了重要作用,可以調節與逆境脅迫相關的基因合成或蛋白表達,從而增強植物抗逆性[15]。GABA富集在生物和非生物脅迫中起了重要作用,可以有效的消除活性氧引起的細胞毒性[16-17]。外源GABA可以顯著提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）這3種抗氧化酶的活性。Park等研究表明,GABA在植物與假單胞菌的互作中發揮重要作用,通過內源含量的提高來增強植物抗病性[18]。在本實驗中在25℃和31℃下GABA都有富集,但在25℃下含量顯著高于31℃,推測GABA旁路的變化可能與增強了枯三生的抗病性有關。

3.3 TMV侵染引起的糖類的變化

糖類在植物的生長、發育和代謝中發揮重要作用,糖類是光合作用的產物也是呼吸作用的底物,為植物生長提供能量并增強植物的抗逆性,糖代謝處于整個生物代謝的核心,溝通了蛋白質代謝、脂質代謝、核酸代謝及次生物代謝[19]。在兩個溫度下,TMV侵染后蔗糖降解都伴隨著葡萄糖和果糖的積累,在N基因失活下,病毒的系統侵染導致了植株需要產生更多的能量來抵御病毒的擴散。

3.4 TMV侵染引起的氨基酸類的變化

脯氨酸是植物體內重要的滲透調節物質,在穩定細胞結構、維持細胞滲透平衡和增強抗逆性方面發揮著重要的作用[20]。在本研究中25℃條件下,處理植株脯氨酸的含量與對照相比上調,說明植物抗逆性增強。在31℃條件下,各種氨基酸的變化規律有所不同,一些可能與阻止氨過量引起細胞毒性的轉氨作用有關,如將天冬氨酸轉化為天冬酰胺。而其他一些氨基酸含量的上調可能與TMV病毒復制的外殼蛋白的物質儲備有關。

3.5 TMV侵染引起的其他物質變化

在25℃下乙醇胺的代謝變化明顯,與對照相比含量上升,乙醇胺屬于多胺類物質,多胺類在抗逆中可以維持膜的穩定性,調節細胞內外陰陽離子的平衡[21]等來增強植株的抗性。肌醇在TMV侵染葉片后,可能參與細胞壁的生物合成,磷脂信號通路或調節細胞骨架[22-24]。研究表明肌醇含量下降導致了滲透壓失衡,影響了碳水化合物分配和運輸[25]。且磷酸肌醇直接參與調控植物對病害等逆境脅迫的抗性[26]。Andersson等的研究顯示丁香假單胞菌侵染植物時,肌醇的濃度下降[27]。表1和表2顯示在25℃和31℃條件下TMV侵染均引起肌醇含量下調,表3顯示在31℃條件下侵染位點肌醇水平高于25℃, 推測肌醇含量改變與病毒侵染有關。

本文對不同溫度下TMV侵染枯斑三生的代謝輪廓進行了分析,明確了25℃和31℃條件下TMV侵染枯斑三生煙株代謝物質的差異,對代謝物變化原因進行了初步分析,為探討高溫介導枯斑三生對TMV天然免疫反應喪失的機理提供了前期的研究基礎。在該研究中也存在代謝組學的普遍問題,如樣本代謝組變化快、穩定性較差、數據處理模式不夠成熟等,這有賴于分析技術和數據處理技術的不斷完善。在今后的研究中,代謝組的研究結果可以同蛋白質組學與轉錄組學相結合,利用代謝通路分析軟件和基因編輯的技術對部分特異性代謝途徑進行定點定向敲除,從而進一步揭示N基因在高溫下失活的機理。

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Metabolic pro fi ling analysis of immune de fi ciency of TMV by high temperature mediated geneN

LIU Xu1,2, WANG Yaofeng3, YU Guanghong4, SONG Yuchuan4, WANG Jie1, SHEN Lili1, WANG Fenglong1, YANG Jinguang1
1 Key Laboratory of Tobacco Pest Monitoring, Controlling & Integrated Management, Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, Shandong, China；2 Graduate School, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3 Gansu Qingyang Municipal Tobacco Company, Xifeng 745000, Gansu, China;4 Yunnan Oriental Tobacco Company, Baoshan 678000, Yunnan, China

High temperature above 28℃ may cause geneNto lose its resistance to TMV infection. This research studied the metabolic di ff erences between TMV-free and TMV-infectedNicotiana tabacumvar. Samsun NN 12h, 24h and 48h after infection at 25℃ and 31℃respectively. Gas chromatography–mass spectrometry and PCA and OPLS-DA were used to determine di ff erent metabolites. By using GCMS, 49 kinds of metabolites were detectable, containing amino acids, sugars, organic acids, organic acids, and polyamine. It was concluded that TMV infectedN. tabacumvar. Samsun NN cause the rise of malic acid, salicylic acid, γ-aminobutyric acid, proline and ethanolamine at 25℃ whileN. tabacumvar. Samsun NN lose its function of geneNwith the decrease of sucrose and inositol and the rise of glucose,fructose and amino acids at 31℃.

TMV; metabolite; geneN

劉旭,王耀峰,余廣宏,等. 高溫介導N基因對TMV免疫喪失的代謝輪廓分析 [J]. 中國煙草學報,2016,22（2）

山東省自然科學基金（ZR2014CQ025)；國家煙草專賣局創新平臺項目自助（023201305）

劉 旭（1991—）,碩士,研究方向為植物病理學,Email: daisyliuxu@163.com

楊金廣（1979—）,博士,副研究員,研究方向為植物病毒學,Tel：0532-88703236,Email: yangjinguang@caas.cn

2015-08-26

: LIU Xu, WANG Yaofeng, YU Guanghong, et al. Metabolic pro fi ling analysis of immune de fi ciency of TMV by high temperature mediated geneN[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(2)