Nicotiana tabacum Lin.- N. plumbaginifolia Viv.雜種的鑒定及其育性和黑脛病抗性的初步分析

黨江波，趙申清玉，鄧紅紅，曹帥，梁國魯，張艷

1 西南大學,園藝園林學院,重慶市北碚區天生路2號 400716；2 中國煙草總公司重慶市公司,煙草研究所,重慶市北碚區天生路2號,400716

Nicotiana tabacumLin.-N. plumbaginifoliaViv.雜種的鑒定及其育性和黑脛病抗性的初步分析

黨江波1，趙申清玉1，鄧紅紅1，曹帥1，梁國魯1，張艷2

1 西南大學,園藝園林學院,重慶市北碚區天生路2號 400716；2 中國煙草總公司重慶市公司,煙草研究所,重慶市北碚區天生路2號,400716

為明確一株云煙87八倍體（2n=8x=96）與N. plumbaginifoliaViv.（2n=2x=20）的雜交后代的部分生物學特性。對該后代進行了形態觀測,細胞學遺傳學分析,育性分析,并進行黑脛病抗性的離體鑒定。結果顯示,該雜交后代（無性系）大部分外觀形態指數介于云煙87四倍體與N. plumbaginifolia之間；花冠顏色與云煙87相近,花藥顏色與N. plumbaginifolia相近。其染色體數目為58條,其中含有來自N. plumbaginifolia的10條染色體。花粉離體培養未見萌發；與云煙87四倍體雜交,做母本時坐果率為100%,平均每個蒴果獲得102.60±25.12粒可萌發的種子,以其為父本及自交時未獲得成熟蒴果。該雜交后代（無性系）對黑脛病抗性強于云煙87,與N. plumbaginifolia相近。綜上所述,該雜交后代為云煙87與N. plumbaginifolia的真雜種（2n=5x=58）；其雄性敗育,但雌性可育；且具較強的黑脛病抗性。

N. tabacum；N.plumbaginifolia；雜種；育性；黑脛病抗性

遠緣雜交是作物育種的主要方法和有效途徑之一,煙草育種中便較早利用遠緣雜交進行品種改良[1-2]。1761-1765 年Koelreuter進行的煙草屬種間雜交（Nicotiana rustica×N. paniculata）成為植物遠緣雜交的經典案例[3]。自上世紀20年代開始,煙草遠緣雜交得到較為系統的開展,且取得較大成就,為普通煙草導入大量優良抗病蟲害基因：先后從N.glutinosa中導入抗TMV基因,從N. longi fl oraa中導入抗野火病基因,從N. debneyi中導入抗根結線蟲病基因,從N. plumbaginifolia、N. longi fl ora、N.stocktonii、N. nesophila和N. repanda中導入抗黑脛病基因,從N. benthamiana中導入抗Spodoptera litura基因,從N. africana中導入抗PVY基因[2,4-11]。可見,遠緣雜交對煙草抗病蟲害育種有重要的意義。

Nicotiana plumbaginifolia屬煙草屬花煙草組（Alatae）,與普通煙草（N. tabacum）雜交親和,對黑脛病、野火病、根黑腐病、根結線蟲病、角斑病等煙草生產中的常見病害具有較強的抗性[12-13]。其中黑脛病對我國煙草生產的危害最大,造成的損失僅次于病毒病[14]。研究證實,N. plumbaginifolia對煙草疫霉菌0號和1號生理小種均具較強抗性,是煙草抗黑脛病的優良抗源[15-16]。利用N. plumbaginifolia進行抗黑脛病育種可改變目前我國煙草育種中黑脛病抗源單一的局面[17-18]。雖然早在1951 年Chaplin便開始了將N. plumbaginifolia的抗黑脛病能力轉移到N.tabacum的研究,且后續育種家以N. plumbaginifolia為抗源育成抗黑脛病品種NC2326等[18],但是這些品種在生產上的應用有限。目前,還未見以N.plumbaginifolia育成抗其它病害的煙草品種。在以往對N. plumbaginifolia與煙草的雜交報道中,并未對雜交后代的主要特征如外觀性狀、育性等進行報道,這對利用N. plumbaginifolia進行育種無疑是較大遺憾[7]。

本文以煙草八倍體（2n=8x=96）與N.plumbaginifolia（2n=2x=20）的雜交后代為材料,采用形態觀測、細胞學方法進行了雜種鑒定；通過花粉活力測定和正反雜交、自交結實開展了育性分析；并通過接種病原菌進行該雜交后代材料的黑脛病抗性鑒定。這對利用N. plumbaginifolia及其與煙草的雜交后代進行煙草抗病育種,特別是抗黑脛病育種有重要的參考價值。此外,煙草與N. plumbaginifolia雜種的獲得對開展N. plumbaginifolia功能基因組研究及其抗病基因的定位大有益處,對利用N. plumbaginifolia進行抗根黑腐病、根結線蟲病、角斑病等育種也具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

普通煙草（Nicotiana tabacumLin）品種云煙87四倍體（2n=4x=48）、野生煙草N. plumbaginifoliaViv.（2n=2x=20）種子均由國家煙草中期庫提供,煙草黑脛病病原菌寄生疫霉煙草致病型（Phytophthora parasiticavat. nicotianae）由西南大學資源環境學院李振輪教授贈送,分離自重慶市奉節縣。

1.2 方法

1.2.1 雜交后代的獲得及擴繁

云煙87四倍體經組織培養獲得無菌苗,無菌苗莖尖經0.2%秋水仙素溶液浸泡48 h后,經分化、增殖、生根培養獲得八倍體植株,移栽田間。盛花期,以其為母本與N. plumbaginifolia雜交獲得種子。種子萌發成苗后移栽至田間,選取其中一株正常生長,經鑒定染色體數目為58的植株為研究對象。

該植株經組織培養獲得無性系植株,誘導培養基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA,增殖、分化培養基為MS+0.2 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA,生根培養基為1/2 MS+2.0 mg/L IBA。

1.2.2 雜交后代（無性系）的形態學觀測

為初步進行雜種鑒定,至初花期時,參考煙草農藝性狀調查方法（YC/T 142-1998）并根據兩個親本基因型云煙87四倍體植株及N. plumbaginifolia植株形態差異對比結果,對該雜交后代（無性系）的在云煙87四倍體和N. plumbaginifolia中差異較大的性狀如株高,莖圍,著生片數,最大葉長、寬和節距進行測定,對其花器官形態進行觀察,拍照記錄。

以云煙87四倍體植株及N. plumbaginifolia植株為對照,每個材料測定株數為10株。

1.2.3 雜交后代的細胞學分析

有絲分裂中期染色體核型觀察：

有絲分裂中期染色體制片參照陳瑞陽等[19]的方法并略有改進,取植株幼嫩葉片,于0.002 mol·L-1的8-羥基喹啉溶液中處理6 h,后用卡洛氏固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）固定過夜。材料經蒸餾水清洗后分解為1 mm2大小,于混合酶液（3%纖維素酶+0.3%果膠酶）中37℃孵育40 min,后吸出酶液,蒸餾水浸泡10 min,吸出蒸餾水,加入卡洛氏固定液。約1 h后于清潔的載玻片上涂抹制片,干燥后用5%吉姆薩染液染色后鏡檢,拍照。

基因組原位雜交（Genomic in situ hybridization,GISH）分析：

GISH參照Brammer 等[20]的方法并加以改進,以N. plumbaginifolia基因組DNA為探針,采用DIGHigh Prime（羅氏）進行標記,云煙87基因組DNA 10倍濃度為封阻,探針終濃度為2.5 ng·μL-1。以Anti-Digoxigenin- fl uorescein （羅氏）對探針進行染色,DAPI襯染,Olympus熒光顯微鏡（日本）進行檢測、拍照,隨機軟件cellSens Standard 1.9 （Olympus,Japan）對照片進行處理。信號顏色模擬為紅色,背景顏色為藍色。

1.2.4 雜交后代（無性系）的育性分析

花粉活力測定：

花粉活力檢測參照謝朝添等[21]的方法配制煙草花粉離體萌發培養基： 0.01%KH2PO4,0.01%CaCl2,0.01% H3BO3和15%蔗糖。25℃培養4 h后顯微鏡下觀察,以花粉管長度大于花粉粒直徑作為萌發標準,統計花粉萌發率。

雜交試驗：

以雜交后代（無性系）為父本、母本與云煙87四倍體進行雜交并進行自交,統計坐果率及種子活力。

1.2.5 雜交后代（無性系）對黑脛病抗性的初步觀測

煙草疫霉菌孢子液準備：

孢子誘導采用KNO3溶液誘導的方法[22-24],將培養2 周以上的菌絲挑入0.1%的KNO3溶液中（每個直徑為9 cm的培養皿中的菌絲轉入20 mL KNO3溶液中）,培養3 d后,經4℃處理40 min后取出,組織破碎儀打斷菌絲,25℃放置20 min后加入1%葡萄糖接種。

病原菌接種及結果觀測：

取雜交后代無性系植株團棵期植株中部的新鮮葉片,置于鋪有濕潤吸水紙的方形搪瓷盤中,用無菌針頭于葉片主脈一側刺穿葉片,取上述菌液10 μL覆蓋于針頭穿刺處。取團棵期莖段,自根莖連接處截取地上部分,去除葉片,下端切口處于上述菌液中浸泡約5 s,待稍干燥后水平置于鋪有濕潤吸水紙的方形搪瓷盤中,切口處用濕潤吸水紙覆蓋。搪瓷盤用封口膜密封保濕,置于30℃黑暗處。分別于接種后4 d、10 d觀察。

2 結果與分析

2.1 雜交后代（無性系）的形態學特征

通過對云煙87四倍體、N. plumbaginifolia及雜交后代（無性系）的株高,莖圍,有效葉數,最大葉片長、寬及花器官等若干特征的觀察測定顯示：該雜交后代（無性系）的株高,莖圍,最大葉長、葉寬和著生葉數均介于云煙87四倍體與N. plumbaginifolia之間,其中云煙87均為最大；而雜交后代（無性系）的節距較云煙87四倍體與N. plumbaginifolia短,N.plumbaginifolia的節間距最大。在葉形方面雜交后代（無性系）與云煙87四倍體更為相近,葉脈更明顯,二級葉脈更清晰且排列規則,葉面密被小絨毛,絨毛腺體不明顯。

表1 雜交后代（無性系）與云煙87四倍體、N. plumbaginifolia部分形態比較Tab. 1 Part of morphological comparison between Yunyan87, N.plumbaginifolia and offspring plants

圖1 雜交后代（B）與云煙87四倍體（A）和N. plumbaginifolia（C）的植株Fig.1 Plant of hybrid offspring plant (B), Yunyan87 tetraploid (A)and N. plumbaginifolia (C)

外觀形態中,花器官也呈現一定的差異。雜交后代（無性系）花器官較云煙87四倍體與N. plumbaginifolia大,其次是云煙87,N.plumbaginifolia的花器官則最小；且花冠顏色存在差異,雜交后代（無性系）的花冠顏色為粉紅色,而云煙87為淺紅色,N. plumbaginifolia為白色（圖2）,可見雜交后代（無性系）花冠顏色與云煙87更為相似；但值得注意的是,雜交后代（無性系）植株花藥顏色成熟未開裂時為褐色,開裂后則為深紫紅色,這與N. plumbaginifolia花藥顏色相同,這應為該雜交后代（無性系）遺傳自N. plumbaginifolia的性狀；雜交后代（無性系）植株花藥大小和云煙87相近,N.plumbaginifolia的花藥則較小。

圖2 雜交后代（b）、云煙87四倍體（a）和N. plumbaginifolia（C）的花（A）及花藥（B）Fig.2 Flower (A) and anther (B) of hybrid offspring plant (b),Yunyan87 tetraploid (a) and N. plumbaginifolia (c)

2.2 雜交后代的細胞學特征

該雜交后代具有58條染色體（圖3B）。由于云煙87四倍體染色體數目為48（圖3A）,而野生煙草N. plumbaginifolia具有染色體20條（圖3C）,因此可以初步鑒定該雜交后代植株為五倍體,即2n=5x=58,可能為2個完整云煙87染色體組外附加1個N. plumbaginifolia的染色體組。這一結論在GISH結果中得到證實（圖3D）。

圖3 雜交后代（2n=58，B）與云煙87四倍體（2n=4x=48，A）、N. plumbaginifolia（2n=2x=20，C）有絲分裂中期染色體及以N. plumbaginifolia基因組DNA為探針進行基因組原位雜交的雜交后代有絲分裂中期染色體形態（D，紅色示源于N.plumbaginifolia的10條染色體）Fig.3 Mitosis metaphase chromosome of hybrid offspring plant(2n=58, B), Yunyan87 tetraploid (2n=4x=48, A), N. plumbaginifolia(2n=2x=20, C) and GISH result of offspring plant metaphase chromosomes when N. plumabginifolia DNA was used as probes(D, red showed 10 chromosomes from N. plumabginifolia)

2.3 雜交后代（無性系）的育性

光學顯微鏡下觀察到,雜交后代（無性系）花粉空癟且大小不均一,而云煙87四倍體和N.plumbaginifolia的花粉飽滿且較為均一（圖4）。經離體萌發試驗檢測,雜交后代（無性系）花粉未見萌發,而云煙87四倍體花粉萌發率為47.31%,N.plumbaginifolia花粉萌發率為55.98%。

圖4 光學顯微鏡下雜交后代（無性系）（b）及云煙87四倍體（a）和N. plumbaginifolia的花粉（c）Fig.4 Pollen of hybrid offspring plant (b), Yunyan87 tetraploid (a)and N. plumbaginifoli under optical microscope (c)

以雜交后代（無性系）為母本,云煙87四倍體為父本,所有雜交花序均能坐果。蒴果中獲得了57-156粒有可以萌發的種子,平均每個蒴果獲得102.60±25.12粒可萌發的種子。但以雜交后代（無性系）為父本與云煙87四倍體雜交以及雜交后代自交均未能獲得成熟蒴果。可見,該雜交后代為雌性可育而雄性敗育。

2.4 雜交后代（無性系）對煙草黑脛病的抗性

黑脛病菌接種后,對照云煙87四倍體葉片自第2d開始出現水漬樣病斑,第3d病斑迅速擴大且發病部位軟化程度加重,第4d病斑超過主脈延伸至葉片另一側。而N. plumbaginifolia和雜交后代（無性系）葉片則未見任何病斑出現（圖5A）。接種后第10d,云煙87四倍體整張葉片全部嚴重軟化并呈略透明的水漬狀,N. plumbaginifolia葉片則出現黃化現象,有不連續黃褐色壞死斑,但未出現水漬樣病斑。雜交后代（無性系）葉片則既未出現黃化亦未出現水漬樣病斑更未出現壞死斑。

圖5 雜交后代（b）及云煙87四倍體（c）和N.plumbaginifolia (a)的葉片（A）及莖段（B）接種煙草疫霉菌后4 d的表現Fig.5 Performance of leaf (A) and stem (B) of hybrid offspring plant (b), Yunyan87 tetraploid (c) and N. plumbaginifolia (a) 4 d after infected by Phytophthora parasitica

云煙87莖段自接種后第2 d自接種切口處開始出現黑褐色略透明的水漬樣病斑,第3 d開始迅速沿莖段軸向延伸,第4 d延伸至莖段接近1/2處（圖5B）。而N. plumbaginifolia和雜交后代（無性系）并未出現壞死現象。接種后第10 d,云煙87莖端全部呈黑褐色軟化半透明水漬狀,N. plumbaginifolia莖端亦全部壞死生長出雜色菌絲,但未呈現水漬狀病斑,為雜菌浸染所致。雜交后代（無性系）則未出現任何病斑。可見,在對重慶分離的黑脛病病原菌的抗性方面,該雜交后代遠遠強于云煙87四倍體,可能是野生煙草對黑脛病的抗性隨基因組的轉移所致。

3 討論

對雜種進行鑒定的方法較多,包括形態學、細胞學以及分子生物學等方法[25-26]。在形態學中,植株形態和花器官形態是主要的判定依據,一般來說雜種的性狀介于親本之間[27]。在本研究中,以云煙87四倍體和N. plumbaginifolia為對照,部分性狀,如植株高度、葉長、葉寬、節間長度是介于二者之間的,而花器官則有所不同,大小及顏色均超過云煙87四倍體和N. plumbaginifolia,這可能是由于該雜交后代的倍性大于四倍體所致。

細胞學鑒定的方法包括染色體數目、形態,基因組原位雜交等技術[28-30]。一般進行精確鑒定時,會對染色體的形態以及顯帶技術較為重視,而大多在對雜交后代進行初步鑒定時,染色體數目鑒定應用較多[31]。本研究所獲得雜交后代染色體數目為58條,且通過GISH結果可知該雜交后代中確有來源于N.plumbaginifolia的完整染色體組10條染色體。因此,可確定該雜交后代為真雜種,并可初步判定為五倍體。但是由于云煙87八倍體在減數分裂過程中可能會形成假整倍性配子,不能排除該雜交后代為類似單-三體類型的假五倍體的可能。

該雜交后代雌性可育,并擁有完整的N.plumbaginifolia基因組,N. plumbaginifolia對諸多煙草病害具有較強抗性,尤其是對煙草主要病害黑脛病、野火病、根黑腐病、根結線蟲病的抗性,這在煙草品種的改良方面具有較大的潛力[2,7,13,16]。本研究結果證實該雜交后代對重慶地區黑脛病分離菌株的抗性與N. plumbaginifolia相當,明顯強于該地區的現有主栽品種云煙87。Li等[24]報道N. plumbaginifolia對1號生理小種的抗性略高于Beinhart,重慶地區的黑脛病優勢小種即為1號小種。Beinhart是目前所知煙草種內對黑脛病抗性最高的品種,由于其抗性與其它基因連鎖,而未能在育種中得到廣泛應用[17-18,32]。可見N.plumbaginifolia與煙草的雜交后代對改良黑脛病高發區域,特別是以黑脛病1號小種為優勢小種的區域的黑脛病抗性育種具有重要的現實意義。

該雜種與云煙87四倍體回交獲得了大量后代,這些后代中可能會篩選到含有少量N. plumbaginifolia染色體的附加的甚至是單體附加的植株,是較為難得的煙草育種和亞基因組研究材料[33]。該雜交后代經物理如γ射線輻射等手段處理,可使外源染色體斷裂后重接,獲得含有外源染色體片段的異源易位系材料,這也是遠緣雜交育種中的理想材料,是獲得優良新株系的重要基礎[34-37]。

4 結論

該雜交后代為煙草與N. plumbaginifolia的真雜種,可能為五倍體（2n=5x=58）；其雄性敗育,但雌性可育；對重慶地區分離的黑脛病病原的抗性強于云煙87四倍體,與其父本N. plumbaginifolia相近。

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Identi fi cation ofN. tabacumLin. andN. plumbaginifoliaViv. hybrid and primary analysis of its fertility and resistance to black shank disease

DANG Jiangbo1, ZHAO Shenqingyu1, DENG Honghong1, CAO Shuai1, LIANG Guolu1, ZHANG Yan2
1 College of horticulture and landscape, Southwest University, Chongqing 400716, China;2 Chongqing Tobacco Research Institute, Chongqing Municipal Tobacco Company, Chongqing 400716, China

Plant morphology of an o ff spring between octoploid plant ofN. tabacumLin. cv. Yunyan87 (2n=8x=96) andN. plumbaginifoliaViv. (2n=2x=20) was observed. Its cytogenetic characteristics, fertility and its resistance to black shank were investigated. Results showed that most main morphology indexes were between Yunyan87 tetraploid plant andN. plumbaginifolia. Corolla color was similar to Yunyan87 while anther color was similar toN. plumbaginifolia. It had 58 chromosomes, among which 10 were fromN. plumbaginifoliadetected by GISH. Pollen did not germinate in vitro and no capsules were harvested when the hybrid (clones) was crossed to Yunyan87 tetraploid plants as male and self. 102.60±25.12 germinating seeds were obtained in every capsule when the hybrid crossed to Yunyan87 tetraploid plants as female. No black shank specks on hybrid leaf and stem were found afterP. parasiticainfection. This was the same withN. plumbaginifolia. The o ff spring was the sure hybrid ofN. tabacumandN. plumbaginifolia(2n=5x=58). It was male sterile but female fertile and has strong resistance to black shank etiology.

N. tabacum;N. plumbaginifolia; interspeci fi c hybrid; fertility; black shank resistance

黨江波,趙申清玉,鄧紅紅,等.Nicotiana tabacumLin.-N. plumbaginifoliaViv.雜種的鑒定及其育性和黑脛病抗性的初步分析[J]. 中國煙草學報,2016,22（2）

中國煙草公司重慶市公司資助項目（No: 2012044）

黨江波（1984—）,博士研究生,主要從事煙草細胞遺傳學研究,Tel：023-68250383,Email：dangjiangbo@126.com

梁國魯（1960—）,主要從事植物細胞遺傳學研究,Tel：023-68250383,Email：lianggl@swu.edu.cn

2015-06-08

：DANG Jiangbo, ZHAO Shenqingyu, DENG Honghong, et al. Identi fi cation ofN. tabacumLin. andN. plumbaginifoliaViv.hybrid and primary analysis of its fertility and resistance to black shank disease[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22(2)