GC-MS/O技術測定卷煙煙氣中巨豆三烯酮的香氣活力值

楊靖，毛多斌，陳芝飛，孫志濤，郝輝，賈春曉，李成剛，王高杰，馬宇平

1 鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，鄭州市東風路5號 450002；2 河南中煙工業有限責任公司技術中心，鄭州市隴海路72號 450000

GC-MS/O技術測定卷煙煙氣中巨豆三烯酮的香氣活力值

楊靖1，毛多斌1，陳芝飛2，孫志濤2，郝輝2，賈春曉1，李成剛2，王高杰2，馬宇平2

1 鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，鄭州市東風路5號 450002；2 河南中煙工業有限責任公司技術中心，鄭州市隴海路72號 450000

以同時蒸餾萃取法萃取卷煙主流煙氣粒相物，利用半制備高效液相色譜法制備含有巨豆三烯酮餾分，采用GC-MS/O技術測定巨豆三烯酮4種同分異構體在卷煙煙氣中的含量和嗅覺閾值，從而獲得了相應香味化合物的香氣活力值（OAV）。結果表明：①巨豆三烯酮a、b、c和d的嗅覺閾值分別為0.81 ng/mL、2.05 ng/mL、3.86 ng/mL和0.88 ng/mL；②巨豆三烯酮4種同分異構體的OAV大小順序為：巨豆三烯酮d（75.58）＞巨豆三烯酮 b（35.35）＞巨豆三烯酮 a（23.01）＞巨豆三烯酮c（2.36）；③利用GC-MS/O技術，可獲得化學性質不穩定或存在多種同分異構體的香味物質OAV，解決了傳統方法無法準確測定的問題。

GC-MS/O；香氣活力值；嗅覺閾值；巨豆三烯酮

香氣活力值（Odor activity value，OAV）是指香氣化合物在香味體系中的濃度與其嗅覺閾值的比值[1]。當OAV 超過（含）1 時，表明香氣化合物對香味體系的香氣有貢獻，其值越高貢獻越大，反之，則其對香氣貢獻可以忽略[2]。對于卷煙煙氣而言，通過比較其中不同香味化合物的OAV大小，可判別哪些香味化合物對卷煙香氣特征起關鍵作用，區分不同香味化合物對卷煙香氣的貢獻程度。

嗅覺閾值指香味化合物在一定介質中被人嗅覺系統所感受到的最低濃度值，通常采用無味的溶劑將香味化合物進行稀釋后，由受過訓練的專業人員嗅辨而得。這種嗅覺閾值的評定方法適合于高純度的標準品，但對結構相對不穩定、純度達不到要求或是含有多種同分異構體的香味物質，則無法直接采用此方法獲得其嗅覺閾值。GC-MS/O（Gas Chromatography-Mass Spectrometer/Olfactometry）技術是將氣相色譜和人體感官相結合的一種分析方法[3]，即在氣相色譜柱末端添加一個分流裝置，將分離后的一部分化合物進入質譜檢測器進行檢測分析，而另一部分則流經嗅辨儀，由嗅辨員對該化合物進行嗅聞分析[4]。該技術的優勢在于測試樣品經氣相色譜柱分離成為單一化合物，消除了雜質和溶劑對該化合物的影響。國內外不少學者已采用此技術對食品和煙草中致香成分香氣特征進行了研究[5-15]，但未見采用GC-MS/O技術測定煙草致香成分香氣活力值的研究報道。

巨豆三烯酮是卷煙重要中性香味成分，具有煙草香和辛香底韻，能顯著增強煙香、改善吸味、調和煙氣、減少刺激性，是卷煙調香不可缺少的香原料。烤煙中巨豆三烯酮含量與中性香氣成分含量呈極顯著正相關關系[16]，在不同品種和等級煙葉中其4種異構體含量也不同[17-22]。由于巨豆三烯酮是含4種同分異構體的混合物，采用傳統方法無法準確獲得四者的嗅覺閾值。因此，利用GC-MS/O技術對卷煙煙氣中巨豆三烯酮的嗅覺閾值進行測定研究，獲得巨豆三烯酮在卷煙煙氣中的香氣活力值，旨在為此類技術在卷煙中的應用奠定基礎，為卷煙調香技術深入開展提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

黃金葉品牌“大金圓”成品卷煙（河南中煙工業有限責任公司提供）。

無水乙醇、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉（AR，國藥集團化學試劑有限公司），乙酸苯乙酯、二氯甲烷（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司），巨豆三烯酮（純度96%，4種異構體混合物，美國Sigma公司）。

RM20H吸煙機（德國Borgwaldt kc公司）；6890/5973N 型氣相色譜/質譜聯用儀（美國 Agilent公司）；Waters 600型高效液相色譜儀（沃特世科技（上海）有限公司）；精密電子天平（感量：0.0001g；上海賽多利斯天平儀器廠）；Sniffer 9000 型嗅辨儀（瑞士Brechbühler公司）。

1.2 方法

1.2.1 前處理

挑取黃金葉“大金圓”成品卷煙50支，采用RM20H吸煙機按GB/T 19609-2004標準對卷煙中的粒相物進行捕集，每支煙捕集8口主流煙氣，將捕集后的劍橋濾片置于 1000mL圓底燒瓶中，隨后加入500mL的超純水，在同時蒸餾萃取裝置的另一端連接1個250mL圓底燒瓶，加入100mL色譜純的二氯甲烷進行同時蒸餾萃取，加熱萃取時間2.5 h，得到二氯甲烷萃取液。用5%(體積百分比，下同)鹽酸水溶液 (20 mL×5)洗滌，合并鹽酸洗滌液，用二氯甲烷（20 mL×3）反萃，合并有機相；再用5%氫氧化鈉水溶液(20 mL×5)洗滌有機相，合并氫氧化鈉洗滌液，用二氯甲烷（20 mL×3）反萃取，合并有機相，即得到中性香氣成分萃取液。加入適量無水硫酸鈉干燥過夜，然后過濾減壓濃縮至1 mL，備用。

1.2.2 樣品的分離制備

將濃縮后的中性香氣成分萃取液采用半制備型HPLC進行分離，色譜柱條件：SunFire Silica硅膠柱(10 μm×10 mm×250 mm)（美國沃特世Waters公司）；檢測器：Waters 2489紫外-可見光檢測器；檢測波長：254 nm；柱溫：20 ℃；流動相和洗脫條件見表1。每10 min收集1個餾分，共收集10個，分別標記為餾分1 ～ 餾分10，分別過濾減壓濃縮至1 mL，并利用GC/MS對其進行定性定量分析，確定含有巨豆三烯酮的餾分及其含量。

表1 HPLC洗脫條件Tab. 1 Elution conditions of HPLC

1.2.3 巨豆三烯酮含量的測定

稱取一定量的乙酸苯乙酯用二氯甲烷定容到50 mL得內標溶液，再分別稱取一定量的巨豆三烯酮用二氯甲烷定容至50 mL得到標準溶液。然后用移液管分別準確量取0.05、0.10、0.50、1.00、3.00和5.00 mL標準溶液于10mL的容量瓶中，加入1mL內標后用二氯甲烷定容，得到一系列不同濃度的標準溶液。以濃度為橫坐標，相對面積為縱坐標，繪制樣品的標準曲線。巨豆三烯酮在主流煙氣中的濃度按照公式（1）計算。

式中：X—巨豆三烯酮在主流煙氣中的濃度（ng/mL)

M—根據標準曲線求出的巨豆三烯酮在每支煙主流煙氣中的量（μg)

8—每支卷煙的抽吸口數

35—每口的抽吸容量（mL)

GC/MS分析條件如下：

色譜柱：HP-5MS石英毛細管柱(30 m × 250 μm,1 μm)；進樣口溫度：280 ℃；載氣：氦氣；柱流量：1.8 mL/min；進樣量：1.0 μL；分流比：10:1；升溫程序為：50 ℃（15 min） 6 ℃/min 140 ℃（5min） 2℃/min 150 ℃（5 min） 3 ℃/min 210 ℃ (10min）；離子源溫度：280 ℃；電離方式：EI；電子能量：70 eV；質量掃描范圍：33～500amu。

1.2.4 嗅覺閾值的測定

1.2.4.1 嗅覺閾值評價要求

嗅辨員應為18～45歲，嗅覺器官無疾病的男性或者女性，經嗅覺測試合格者；嗅辨員當天不能攜帶或使用有氣味的香料和化妝品，不能食用有刺激氣味的食品；嗅聞室內通風條件良好并保持17～25℃。

1.2.4.2 評價訓練

嗅辨員首先反復嗅聞巨豆三烯酮（4種異構體混合物）樣品以掌握其香氣特征，然后將制備的樣品按照1/3n梯度進行稀釋后進樣，在GC-MS/O上采用芳香萃取物稀釋分析法（AEDA）進行練習[9-11]，嗅辨從低濃度到高濃度進行，GC毛細管的流出物被1:1分流，一部分進入質譜進行結構鑒定，一部分進入嗅覺端口被嗅辨員吸聞，質譜檢測與嗅辨同時進行，聞到的氣味即為所檢測到物質的氣味，反復訓練以培養嗅辨員在儀器上的嗅辨感覺及嗅辨技巧。

1.2.4.3 GC-MS/O操作條件

GC-MS條件參照1.2.3；嗅辨儀條件：ODP端口分流比：1:1；ODP溫度300℃，補充氮氣，流速10 mL/min。

1.2.4.4 嗅覺閾值的辨識

將利用半制備HPLC處理獲得的含有巨豆三烯酮的餾分濃縮定量后，按照1/3n梯度進行稀釋，得到不同濃度樣品溶液，按照1.2.4.3操作條件進樣，同時由嗅辨員在GC-MS/O嗅覺端口嗅辨。巨豆三烯酮在嗅覺端口的濃度按照公式（2）計算。

式中：A—嗅覺端口的目標物濃度（ng/mL) ;

Y1—ODP端口的樣品溶液進樣量（μL);

Y2—在樣品溶液中的目標物濃度（μg/mL);

Z1—ODP載氣流速（mL/min);

Z2—目標物出峰時長（min)。

嗅辨員在嗅聞時只需分辨出有氣味或無氣味兩種狀態，將結果列入香料嗅覺閾值評價結果統計表中。對照顯著性檢驗結果表[23]判別評價結果：當答對人數小于表中的人數時，表明該香料樣品濃度在閾值之下，否則在閾值之上。重復嗅辨，直至找到相鄰的兩個濃度（即低濃度與高濃度之比為1:3，下同），其中一個濃度在作用閾值以上，另一個濃度在閾值以下，初步確定該香味化合物嗅覺閾值介于上述兩個濃度之間。然后，按照黃金分割法由高向低分割濃度并進行嗅辨，直至高低兩個濃度處于同一個數量級，取高濃度點作為該香味化合物的嗅覺閾值。

1.2.5 OAV值的計算

按照公式（3）計算目標香味化合物的OAV。

2 結果與討論

2.1 定量分析

2.1.1 工作曲線

4種巨豆三烯酮同分異構體的標準工作曲線線性回歸方程、相關系數和線性范圍見表2。

表2 標準曲線、相關系數及線性范圍Tab. 2 Linear equations, correlation coefficients and linear ranges

從表2可以看出，在所測定的濃度范圍內，巨豆三烯酮4種同分異構體標準工作曲線的相關系數都在0.999以上，說明4種樣品標準回歸曲線的相關性很好；其線性范圍較寬，可以滿足定量分析測試要求。巨豆三烯酮4種同分異構體的相對標準偏差分別為7.27%、3.11%、4.59%和1.38%，均小于8%；加標回收率介于89%和108%之間，說明該方法精確度好，適合進行定量測定；4個樣品最大檢測限為13.49 ng/mL，遠低于卷煙煙氣中巨豆三烯酮4種同分異構體的含量，可以滿足定量分析測試要求。

2.1.2 分析結果

將HPLC分離制備出的10個餾分分別進行GC/MS分析，結果表明，只在餾分9中檢測出巨豆三烯酮。巨豆三烯酮餾分的GC/MS總離子流分別見圖1。

圖1 巨豆三烯酮的GC-MS總離子流圖Fig. 1 TIC chromatogram of megastigmatrienone by GC-MS

巨豆三烯酮的含量進行了6次平行測定，結果取平均值。結果表明，分析樣品中巨豆三烯酮4種同分異構體的含量分別為260.9 μg、1014.6 μg、127.4 μg和931.1 μg。因此，由公式（1）可以計算出每支卷煙主流煙氣中中巨豆三烯酮4種異構體的含量分別為18.64 ng/mL、72.46 ng/mL、9.11 ng/mL和66.51 ng/mL。

2.2 嗅覺閾值的評定

將巨豆三烯酮餾分按照1/3n的比例進行梯度稀釋，獲得4個不同濃度的巨豆三烯酮溶液，見表3。

按照1.2.4.3操作條件進樣，同時由嗅辨員在GCMS/O嗅覺端口嗅辨，嗅覺端口的巨豆三烯酮濃度按照公式（2）計算，結果見表4。

表3 巨豆三烯酮4種同分異構體的濃度Tab. 3 Concentrations of four isomers of megastigmatrienone

表4 巨豆三烯酮的嗅覺閾值評定結果Tab. 4 Evaluation results of odor threshold values of megastigmatrienone

表4結果顯示，巨豆三烯酮4種同分異構體的嗅覺閾值范圍分別為0.63 ～ 1.88 ng/mL、0.68 ～ 2.05 ng/mL、1.29 ～ 3.86 ng/mL和0.68 ～ 2.04 ng/mL。按照黃金分割法由高濃度向低濃度進行分割，獲得黃金分割點濃度的溶液，其中巨豆三烯酮4種同分異構體濃度分別為51.1 μg/mL、66.3 μg/mL、74.9 μg/mL和60.8 μg/mL。然后，再次進行嗅辨，結果見表5。

綜合表4和表5評價結果，巨豆三烯酮a的嗅覺閾值介于0.63 ～ 1.11 ng/mL，巨豆三烯酮b介于1.21～ 2.05 ng/mL，巨豆三烯酮c介于2.27 ～ 3.86 ng/mL，巨豆三烯酮d介于0.68 ～ 1.20 ng/mL。其中，巨豆三烯酮b和c的嗅覺閾值上下兩個濃度處于同一數量級，可以確定此二者的嗅覺閾值；而巨豆三烯酮a和d尚未處于同一數量級，還需按照黃金分割法由高濃度向低濃度對其進一步分割，分別獲得二者濃度分別為37.4 μg/mL和44.5 μg/mL的溶液，再次進行嗅辨，評定結果見表6。

表5 巨豆三烯酮的嗅覺閾值評定結果Tab. 5 Evaluation results of odor threshold values of megastigmatrienone

表6 巨豆三烯酮a和d的嗅覺閾值評定結果Tab. 6 Evaluation results of odor threshold values of megastigmatrienone a and d

由表5和表6可知，巨豆三烯酮a的嗅覺閾值介于0.63 ～ 0.81ng/mL，巨豆三烯酮d介于是0.68 ～0.88ng/mL，此二者嗅覺閾值上下兩個濃度已處于同一數量級。

因此，綜合以上分析結果，巨豆三烯酮4種同分異構體的嗅覺閾值分別為0.81 ng/mL、2.05 ng/mL、3.86 ng/mL和0.88 ng/mL。

2.3 香氣活力值的確定

根據巨豆三烯酮在卷煙煙氣中的嗅覺閾值及含量，分別計算其在卷煙煙氣中的OAV，結果見表7。

表7 巨豆三烯酮的OAVTab. 7 OAV of megastigmatrienone

表7結果顯示，巨豆三烯酮a、b、c和d的OAV均大于1，說明其對黃金葉“大金圓”卷煙香氣具有顯著貢獻；4種香味化合物對卷煙香氣的貢獻大小順序為：巨豆三烯酮d＞巨豆三烯酮b＞巨豆三烯酮a＞巨豆三烯酮c。

3 結論

采用同時蒸餾萃取法萃取黃金葉“大金圓”卷煙煙氣主流粒相物，經酸堿洗滌和反相萃取后，再利用半制備高效液相色譜法進行分離，制備含有巨豆三烯酮的餾分。以此餾分為研究對象，采用GC-MS/O技術進行嗅覺閾值測定，結果顯示，巨豆三烯酮a、b、c和d的嗅覺閾值分別為0.81 ng/mL、2.05 ng/mL、3.86 ng/mL和0.88 ng/mL。同時，采用內標法進行定量分析，結果表明主流煙氣中4種同分異構體的含量分別為18.64 ng/mL、72.46 ng/mL、9.11 ng/mL和66.51 ng/mL。由此，獲得相應的OAV分別為23.01、35.35、2.36和75.58，表明4種同分異構體對黃金葉“大金圓”卷煙香氣均有顯著貢獻，貢獻大小順序為：巨豆三烯酮d＞巨豆三烯酮b＞巨豆三烯酮a＞巨豆三烯酮c。該技術解決了傳統方法無法準確測定存在多種同分異構體或化學性質不穩定的香味物質OAV的問題。

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Abstrac:Simultaneous distillation and extraction was applied to handle cigarette mainstream smoke particles, and fractions containing megastigmatrienone were prepared using Semi-preparation HPLC. Contents and odor threshold values of megastigmatrienone in tobacco smoke were determined by GC-MS/O respectively, and odor active values (OAV) were obtained. Results showed that: 1) Odor threshold value of four isomers of megastigmatrienone was 0.81 ng/Ml, 2.05 ng/mL, 3.86 ng/mL and 0.88 ng/mL respectively. 2) OAVs of four isomers of megastigmatrienone were in the order of megastigmatrienone d (75.58) ＞ megastigmatrienone b (35.35) ＞ megastigmatrienone a (23.01) ＞ megastigmatrienone c (2.36). 3) Odor threshold values of flavoring substances which possessed unstable chemical properties or several isomers could be determined accurately by using GC-MS/O technology, and hence the odor active values (OAV) in the cigarette smoke. The technology boasted accurate determination of OAVs of flavoring substances compared with traditional methods.

Determination of odor active values of megastigmatrienone in cigarette mainstream smoke by GC-MS/O

YANG Jing1， MAO Duobin1，CHEN Zhifei2，SUN Zhitao2，HAO Hui，JIA Chunxiao1，LI Chenggang2，WANG Gaojie2， MA Yuping2
1 School of Food and Biological Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China;2 Technology Center, China Tobacco Henan Industrial Co., Ltd., Zhengzhou 450000, China

GC-MS/O; odor active value; odor threshold values; megastigmatrienone

楊靖，毛多斌，陳芝飛，等. GC-MS/O技術測定卷煙煙氣中巨豆三烯酮的香氣活力值[J]. 中國煙草學報，2016,22（6）

楊 靖（1972—），碩士，副教授，主要從事煙草化學與香精香料研究工作，Email: y0ung@126.com

陳芝飛（1979—），碩士，副研究員，主要從事卷煙調香和煙草化學研究，Email: chenzhfei@126.com

2015-11-18

:YANG Jing, MAO Duobin,CHEN Zhifei, et al. Determination of odor active values of megastigmatrienone in cigarette mainstream smoke by GC-MS/O[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(6)