芯片級非對稱場離子遷移譜技術快速識別不同霉變煙草

周沅楨，張強，羊一濤，李靈鋒，汪小知

1 紅云紅河集團紅河卷煙廠，云南省彌勒市桃園路50號 652399；2 云南瑞升煙草技術（集團）有限公司，昆明市高新開發區海源北路1699號 650106；3 浙江大學蘇州工業技術研究院，江蘇省蘇州市高新區錦峰路8號5號樓 215000；4 浙江大學信息與電子工程學系，杭州市西湖區浙大路浙江大學玉泉校區微電子樓 310027

芯片級非對稱場離子遷移譜技術快速識別不同霉變煙草

周沅楨1，張強2，羊一濤1，李靈鋒3,4，汪小知4

1 紅云紅河集團紅河卷煙廠，云南省彌勒市桃園路50號 652399；2 云南瑞升煙草技術（集團）有限公司，昆明市高新開發區海源北路1699號 650106；3 浙江大學蘇州工業技術研究院，江蘇省蘇州市高新區錦峰路8號5號樓 215000；4 浙江大學信息與電子工程學系，杭州市西湖區浙大路浙江大學玉泉校區微電子樓 310027

建立了頂空進樣法—芯片級非對稱場離子遷移譜(Microchip-based FAIMS)技術快速識別霉變煙草。在常壓條件下，以經過活性炭和分子篩凈化的空氣為載氣，同時在正負離子模式下進行檢測。在優化的條件下（載氣流量2000 mL/min，頂空溫度為25℃，樣品氣流為100 mL/min），對不同霉變程度煙草進行定性分析，建立識別規則，依據規則識別煙草霉變程度，識別率達90%以上，實現對203種煙草的快速檢測。對得到不同煙草的特征峰，利用解析-氣相色譜-質譜儀器（TD-GC-MS）定性分析不同霉變狀態煙草的特征霉變物質，驗證FAIMS測試結果。煙草特征峰在指定的CV值和DF值下，離子電流值值存在顯著性差異，利于識別。方法重復性的相對標準偏差RSD≤5%。因此，FAIMS檢測技術可用于快速識別霉變煙草的方法開發。

非對稱場離子遷移譜；霉變煙草；識別

煙草霉變的預防和控制，一直是煙草行業中重要的課題。煙葉吸濕性強，煙葉中又含有微生物生長所需要的營養物質[1]，環境變化極易使煙草發生霉變。嚴重霉變的煙草甚至可能產生毒素，出現煙草安全問題[2]。傳統驗證煙草霉變檢測的方法是眼看、手捏、鼻聞或檢測菌落密度，這些方法耗時長，準確性低且具有滯后性[3]。近年出現以GC-MS法測定煙草霉變標記物植物甾醇的研究[4]， Meruva NK等利用CLSGC-MS對煙草中微生物菌類化學標記物[5]進行研究，此方法準確性較高，但前處理復雜，成本高，操作人員需要一定技術基礎，難以滿足煙草霉變快速檢測的要求。

芯片級非對稱離子遷移譜（Microchip-based Feild Asymmetric Ion Mobility Spectrometry，Microchipbased FAIMS）是一種在傳統離子遷移譜基礎上發展起來的氣相離子分離技術，它是基于不同離子遷移率在常壓高電場條件下呈非線性變化的特點，對正負離子同時進行掃描，離子在遷移區受非對稱波形電場和補償電壓共同作用，到達檢測器完成離子分離與識別。傳統離子遷移譜存在儀器體積和靈敏度之間的矛盾，為提高靈敏度而增加遷移管長度和體積，使得檢測時間延長、儀器功耗增大，相比之下，芯片技術與FAIMS技術相結合，儀器體積減小，耗能降低，縮短了檢測時間，具有分析速度快、靈敏度高、低成本及無需復雜前處理的特點[6-7]。FAIMS技術在生物醫藥、環境檢測及爆炸物毒品分析[8-11]等領域廣泛應用，但目前在煙草霉變檢測還未有應用。本文基于Microchip-based FAIMS技術，以經過活性炭和分子篩凈化的空氣為載氣利用頂空進樣法，選取煙草樣本通過實驗優化測試條件，依據優化后分析條件實現對203種煙草樣品霉變的快速識別檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

（1）樣品：203種不同霉變程度煙草（云南瑞升煙草技術（集團）有限公司提供），包括：63種霉變煙草，140種未霉變煙草。（煙草的霉變狀態由云南瑞升煙草技術（集團）有限公司技術中心驗證）；1-戊醇和吡啶均為分析純（阿拉丁試劑）。

（2）儀器：FAIMS譜儀（蘇州微木智能系統有限公司研制，配有63Ni電離源：FAIMS芯片遷移溝道尺寸參數：寬度35 μm，深度300 μm；芯片遷移區長度3.25 mm，寬度2.5 mm）。頂空進樣裝置（蘇州微木智能系統有限公司制造）；Agilent7890A-5975C GC-MS（美國Agilent公司）；Markes Unity熱解析儀（英國Markes公司）；Tenax-TA采樣管（英國Markes公司）；無油空壓機（上海歐譜力機械有限公司）；Scout SE電子天平（奧豪斯儀器有限公司，感量0.01 g）。

1.2 方法

測試樣品氣體由頂空進樣裝置產生：使用電子天平分別稱取煙草樣品各0.3 g，無需前處理，依次將煙草樣品放入干凈頂空進樣器中進行分析。采用的測試條件為：

（1）FAIMS電壓參數：射頻電場強度可達60000 V/cm，掃描范圍為最高射頻電場（電場強度，DF%）的20%～65%，頻率為25 MHz，直流補償電壓掃描范圍為-6～+6 V。

（2）FAIMS檢測條件：設置樣品氣流速為100 mL/min，載氣流速為2000 mL/min，測試壓強為常壓，檢測溫度為25℃，同步記錄FAIMS檢測圖譜信號。其中載氣為經過活性炭和分子篩凈化的空氣。

（3）TD-GC-MS煙草霉變標記物篩查驗證測試：用Tenax-TA吸附管分別對未霉變與霉變煙草在相同測試條件下的樣品氣體吸附采樣，熱解析儀解析脫附，利用GC-MS對樣品氣檢測，對煙草霉變標記物及FAIMS識別結果進行對比判定。測試條件如下：

a.TENAX TA采樣管采樣條件：老化TENAX TA采樣管，用抽氣泵以100 mL/min抽氣采樣，連續采樣30 min后用于TD-GC-MS分析。

b.吹脫捕集主要條件：吹脫氣體為高純氮氣，解析時間為4 min，解析溫度為250℃，吹脫時間4min，冷阱溫度-10℃，線溫150℃，閥溫150℃。

c.氣相色譜條件：HP-5MS氣相色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，程序升溫，80℃保持22 min，10℃/min升至260 ℃，保持20 min。傳輸線溫度200℃。載氣He氣，流速1.2 mL/min，分流進樣口，分流比5：1。

d.質譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，全掃描采集模式，質量范圍20 ～500 amu。

（4）煙草霉變識別：利用FAIMS識別軟件對203種煙草樣本測試結果進行判定，建立煙草信號識別規則點，分析圖譜信號，判別煙草霉變程度。實驗結果對比煙草驗證結論，驗證識別的正確率。

（5）方法重復性測試：選擇1種煙草樣品，在同一檢測條件下，重復測試6次，根據檢測得到正模式的峰圖的離子電流值，用相對標準偏差RSD表示方法重復性的優劣。

2 結果與分析

2.1 FAIMS檢測條件的優化

影響FAIMS檢測的因素主要是氣壓，溫度、濕度和流量，本實驗是在常壓下進行，所用載氣是由無油空壓機制得并經分子篩和活性炭處理的空氣，可以確保濕度恒定。FAIMS儀器在出廠時已經對離子過濾器和檢測器氣溫進行優化，通過加熱熱電阻保持在100±0.1℃。因此這里僅對樣品溫度和載氣流量這兩個因素進行優化，以儀器檢測信號的分辨率和和響應值作為優化指標，選取1種煙草為優化對象。

2.1.1 頂空進樣溫度

考察 了溫度為25℃，35℃，45℃，55℃和65℃對特征峰的影響。結果表明，隨著溫度升高203種煙草的特征信號減弱，干擾雜質峰響應信號增強。這是因為煙草成分較為復雜，當溫度升高后，煙草含有的雜質也不斷釋放，在參與競爭反應離子的過程中，雜質分子爭得的離子數目也在增加，響應信號逐漸增強，由于反應離子的總電荷數是固定的，使得煙草霉變特征峰的信號減弱，這個反應過程與測試物質的質子親和能有密切關系[12-13]。圖1可看出隨著溫度升高，特征離子電流值降低。因此實驗選取25℃為最優的測試溫度，該溫度也表明儀器在實際測試中也可在室溫下進行樣品檢測。

2.1.2 樣品流量和載氣流量

固定樣品氣流速為0.1 L/min，考察了載氣流速為1.5 L/min、1.8 L/min、2.0 L/min、2.2 L/min和2.5 L/min對儀器靈敏度和分辨率的影響。結果見圖2，在載氣流速逐漸增加的過程中，煙草特征峰的離子電流值逐漸增加，當載氣流速大于2.0 L/min離子電流值迅速降低，這是由于載氣流速增加導致待測樣品滯留時間減少，還未檢測就被帶離檢測器，使得響應信號減小。同時，當載氣流速較高時，會導致樣品離子經過遷移區的時間減小，沿垂直電極板方向的位移減小，離子未碰撞到遷移區極板上的幾率增加[14]，導致半峰寬增加，分辨率降低。因此，綜合考慮靈敏度和儀器的分辨率，選擇樣品氣流速0.1 L/min，載氣流速為2.0 L/min作為樣品的測試條件。

圖1 頂空溫度的影響Fig. 1 Effect of head-space temperature

2.2 不同霉變程度的煙草的FAIMS 譜圖

依據優化后的實驗條件，煙草均在正模式下有明顯的特征信號出現。在不同的電場強度下進行補償電壓和離子電流值的連續掃描，得到不同的響應信號，煙草在正模式下有較為明顯的特征峰，不同霉變程度的煙草全場掃描所得的典型譜圖如圖3所示。由于霉變程度不同，煙草所含有的特征物質的量不同，測試所得的離子電流值不同。霉變的程度決定了其在正模式下圖譜的信號。三種不同霉變程度的煙草在電場強度為40%的信號對比圖如圖3(D)所示：霉變程度越重，特征峰離子電流值越低；霉變越輕，特征峰離子電流值越高。

圖2 載氣流速的影響Fig. 2 Effect of carrier-gas flow rate

圖3 FAIMS煙草圖譜Fig. 3 FAIMS spectrum of different mildew tobacco

2.2.1 TD-GC-MS煙草霉變標記物篩查驗證測試

依據驗證測試流程，從203種煙草樣本中隨機選擇30種未霉變和30種霉變煙草，進行TD-GC-MS測試，對比FAIMS檢測煙草所得特征峰信號，對煙草霉變特征標記物質篩查判定。根據測試結果，選擇具有代表性的未霉變煙草和霉變煙草的色譜分析結果，如圖4中A（不同霉變程度煙草總離子流圖）和B（圖A中測試時間4.5 min至6 min范圍內信號放大圖）所示：根據質譜分析得出煙草霉變的特征標記物為吡啶和1-戊醇，實驗選擇最終有響應信號的特征物質作為分析對象，傳統霉變標記物對于FAIMS無明顯響應(由于FAIMS的特殊離子交換反應機理，煙草自然揮發形成的吡啶和1-戊醇響應信號遠遠強于蘑菇醇，無法獲得該物質的特征信號；麥角甾醇由于較高的熔沸點在室溫下難形成樣品氣被檢測到）。由于FAIMS檢測所得樣品信號強度與樣品含量成正比，根據煙草測試響應信號對比分析得到：未霉變煙草中1-戊醇的相對含量較高，吡啶較低，當煙草霉變后，1-戊醇的相對含量降低，吡啶的含量增加，當煙草霉變較重時吡啶的相對含量最高。

2.2.2 煙草霉變FAIMS特征標記物驗證

依據TD-GC-MS篩選出的特征標記物1-戊醇（A）和吡啶（B）與不同霉變程度煙草FAIMS特征物質的圖譜進行驗證比對。如圖5與圖6所示：在場強DF為40%下，1-戊醇（a）與未霉變煙草(b)的特征峰二維圖的補償電壓值一致，吡啶(c)與霉變嚴重煙草(d)的特征峰的二維圖的補償電壓值一致。煙草霉變特征物質的離子電流值變化趨勢與FAIMS測試結果相符。

2.3 煙草霉變識別

結合FAIMS技術不同電電場強度度下物質的特征峰響應信號的差異，開發了識別不同物質的規則方法和識別軟件。考慮本實驗檢測物質為煙草，不同霉變程度的煙草在正模式下的特征信號差異變化較為明顯，本文選擇正模式建立識別規則點，對煙草是否霉變進行判定。識別點包含補償電壓（CV）值、電場強度（DF）值和離子電流值（ICV）三個變量。若被測物質在識別區域內同時滿足設定規則三個變量的要求，即在指定的CV值和DF值下，離子電流值符合設定的要求，判定標準即識別規則點為全黑即符合，給出定性判別結果。識別規則如表1所示。利用含三種變量的規則識別軟件分別對203種煙草樣本進行識別，其中正確判定為霉變嚴重的有36種，霉變輕的有24種，未霉變的有130種，識別結果依據煙草霉變行標測試進行對比驗證，正確率達90%以上，誤判率小于10%（依據測試煙草行標驗證結果，對比制定煙草識別規則要求：10種未霉變煙草錯判定為霉變輕煙草，3種霉變輕煙草錯判定為霉變重煙草）。識別判定圖示如圖7所示：未霉變煙草(1)；霉變較輕煙草(2)；霉變嚴重煙草(3)。

圖4 不同霉變程度煙草總離子流圖Fig. 4 Total ion current chromatogram of different mildew degree of tobacco

圖5 特征物質FAIMS譜圖Fig. 5 FAIMS spectrum of characteristic substances

圖6 特征物質樣品信號與煙草特征信號對比Fig. 6 Characteristic signal comparison between samples and tobacco

表1 煙草霉變識別規則Tab. 1 Recognition rules of mildewy tobacco

2.4 煙草霉變識別特征參量差異性分析

霉變識別的重要特征參量離子電流值對于不同霉變程度的煙草其數值的分布范圍不同。對比識別規則，從三種不同霉變狀態煙草測試總數據中（每個煙草樣品均重復測試6次作為有效數據計算）各選擇100個進行對比分析，三種狀態煙草的離子電流值波動變化范圍如圖8A（50%DF離子電流值變化）和圖8B（40%DF離子電流值變化）所示：離子電流值不存在交叉，差異明顯，數值變化均符合識別規則設定的限值要求。從上述有效數據中隨機抽取未霉變，霉變較輕和霉變嚴重煙草數據樣本各41個，根據t檢驗法，對不同霉變程度煙草的離子電流值的差異顯著性水平進行分析，分別計算40%DF和50%DF下不同狀態煙草兩兩對比的t值，計算結果如表2中所示。依據t檢驗法查表得出t0.05,80=1.990，可見t計算均大于t表，說明三種不同狀態煙草的離子電流值存在顯著性差異，可明顯識別區分。

圖7 煙草識別結果Fig. 7 Recognition results of different tobacco

圖8 不同霉變程度的煙草特征離子電流值的分布Fig. 8 Distribution of ion current value

同時對相同狀態煙草的離子電流值的差異水平分析得出：40%DF下計算所得t值分別為0.03（未霉變）、0.003（霉變輕）和0.98（霉變重），50%DF下計算所得t值分別為0.61（未霉變）、0.27（霉變輕）和0.31（霉變重），t計算均小于t表，說明同種狀態煙草的離子電流值無顯著性差異，測試結果和方法可用。

2.5 方法的重復性

選取1種煙草為例，嚴格控制操作條件，按照1.2的方法制得6份相同的煙草樣品，在上述優化后的條件下進行檢測，所得的正模式下3個峰的峰值（離子電流值）的相對標準偏差RSD≤5%，該方法的重復性良好。

3 結論

綜上所述，采用頂空進樣-芯片級FAIMS檢測技術對203種煙草進行快速檢測分析，利用煙草在正模式的特征峰的響應信號建立識別規則，以響應信號在特定CV值對應的離子電流值作為識別依據，使得霉變程度不一的煙草得到有效檢測識別，識別正確率達到90%以上，不同霉變程度煙草測試所得特征峰離子電流值存在顯著性差異，有利于煙草霉變正確識別。方法和數據的重復性較好。對于批量煙草霉變的快速識別還需進一步優化檢測條件和識別軟件規則，提高FAIMS對于煙草識別的能力。FAIMS技術可為今后煙草霉變快速檢測和實時在線監控方法開發提供技術參考。

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Rapid identification of different tobacco mildew through microchip-based field asymmetric ion mobility spectrometry

ZHOU Yuanzhen1, ZHANG Qiang2, YANG Yitao1, LI Lingfeng3,4, WANG Xiaozhi4
1 Honghe Cigarette Factory, Hongyun Honghe Group, Mile 652399, Yunnan, China;2 Yunnan Reascend Tobacco Technology (Group) Co., Ltd, Kunming 650106, China;3 Suzhou Industiral Technology Research Institute, Zhejiang University, Suzhou 215000, Jiangsu, China;4 Department of Information Science & Electronic Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China

Microchip-based high-field asymmetric ion mobility spectrometry (FAIMS) technology was used for rapid identification of tobacco mildew. Sample gas was introduced by a dynamic headspace diffusion method. Using FAIMS technology, the sample was tested in positive and negative ion mode under atmospheric conditions with clean air (carrier gas: filtered by activated carbon and molecular sieve). To optimize detection conditions, carrier gas flow rate and sample flow rate were controlled at 2000mL/min and 100 mL/min, respectively. Headspace temperature was controlled at 25 ℃.Under optimal conditions, recognition rules of the degree of mildewy tobacco were established according to identification points. Identification points included three variables of the compensation voltage (CV), electric field (DF) strength and ionic current value (ICV).Characteristic substances of different mildewy tobacco were analyzed by TD-GC-MS. There was a significant difference among Ion current value of characteristic peaks for different mildewy tobacco. The recognition rate of this method was more than 90 percent with relative standard deviation(RSD) lower than 5%. Therefore, FAIMS detection technology has a great potential for application in rapid identification of tobacco mildew.

field asymmetric ion mobility spectrometry; tobacco mildew; identification

周沅楨，張強，羊一濤，等. 芯片級非對稱場離子遷移譜技術快速識別不同霉變煙草[J]. 中國煙草學報，2016,22（6）

江蘇省基礎研究計劃（自然科學基金）資助項目“基于MEMS工藝的新型離子源FAIMS技術的研究”（BK20130340）；浙江省博士后科研擇優資助項目“基于MEMS工藝的新型離子源場強場非對稱離子遷移譜的開發和理論研究”（BSH1302040）；中國博士后科學基金資助項目“基于碳納米材料光電效應的新型離子源的研制”（2013M531448）

汪小知（1983—），副教授，博士研究生導師，主要從事微納米器件、新型材料傳感器的研究，Email：xw224@zju.edu.cn

2016-04-22

：ZHOU Yuanzhen, ZHANG Qiang, YANG Yitao, et al. Rapid identification of different tobacco mildew through microchip-based field asymmetric ion mobility spectrometry [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22(6)