不同類型流式細胞儀檢測卷煙煙氣體外微核比對研究

高茜，繆明明，李雪梅，楊陟華，毛健，盧斌斌，鄭賽晶，劉姜瑾，夭建華

1 云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南省昆明市科醫路41號 650106；2 軍事醫學科學院，北京市海淀區太平路27號 100850；3 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南省鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001；4 上海煙草集團有限責任公司，上海市楊浦區長陽路717號 200082；5 湖南中煙工業有限責任公司，長沙市芙蓉區紫薇路210號 410016

煙草設備

不同類型流式細胞儀檢測卷煙煙氣體外微核比對研究

高茜1，繆明明1，李雪梅1，楊陟華2，毛健3，盧斌斌3，鄭賽晶4，劉姜瑾5，夭建華1

1 云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南省昆明市科醫路41號 650106；2 軍事醫學科學院，北京市海淀區太平路27號 100850；3 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南省鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001；4 上海煙草集團有限責任公司，上海市楊浦區長陽路717號 200082；5 湖南中煙工業有限責任公司，長沙市芙蓉區紫薇路210號 410016

目的：為了評估流式細胞儀（FCM）檢測卷煙煙氣體外微核的廣泛適用性和穩定性。方法：采用4種不同類型的FCM，對國內5種品牌的卷煙煙氣總粒相物（TPM）處理的中國倉鼠卵巢細胞(CHO)和人支氣管上皮細胞（BEAS-2B）微核進行檢測并比較檢測數據。結果：不同類型FCM檢測參數差異較大，但經過調整優化之后均可達到卷煙煙氣體外微核檢測的技術要求。不同類型FCM測定的微核率之間統計學分析沒有顯著差異（P＞0.05）。結論：不同類型的FCM均適用于卷煙煙氣體外微核的檢測，且檢測結果具有一致性和穩定性。

流式細胞儀；卷煙煙氣總粒相物；微核

流式細胞儀（ fl ow cytometry，FCM）是于20世紀70年代發展起來用于定量測定細胞和亞細胞的儀器。其工作原理是將待測樣品進行熒光染色并制成懸液，然后以單個顆粒的狀態通過激光束，同時用光電倍增管記錄散射光和熒光信號，并傳輸到計算機上進行信號同步檢測分析，以達到定量測定的目的[1]。FCM檢測方法具有檢測速度快、樣品制備簡單等優點，在生命科學領域得到了廣泛的應用[2-4]。20世紀以來，FCM法逐漸開始應用于體外微核的檢測。2010年經濟合作與發展組織 (Organization for Economic Co-operation and Development，OECD) 在《遺傳毒性指導原則》中提到可使用高通量自動化的系統對微核進行檢測和計數[5]。長期以來，人們研究較多的是無核細胞如紅細胞微核的FCM檢測，而對有核細胞微核的FCM檢測研究較少[6-7]，原因是微核與細胞核在核酸染料標記后發出相同的熒光，難以用儀器分辨。但是有核細胞（如淋巴細胞、組織脫落細胞和生殖細胞等）的微核率是一項重要的生物劑量監測指標，于是研究者們開始積極探索有核細胞微核的FCM檢測方法[8-9]。研究人員曾用FCM檢測大鼠原代培養肝細胞微核，取得了比較理想的結果[10]。同樣，其他類型的培養細胞如淋巴細胞微核的FCM自動化檢測也取得了一定的進展[11]。2008年，國際多家實驗室參與了一項評價FCM體外微核自動檢測方法在小鼠淋巴瘤L5718Y細胞的應用試驗，采用的是BD公司的不同型號的FCM，試驗結果表明FCM方法在各家實驗室具有較好的重復性[12]。本項目組近年也使用Litron實驗室開發的試劑盒建立了煙氣的體外微核FCM自動檢測法[13]。但由于不同類型的FCM存在差異，目前國內外仍沒有該方法的操作指南和標準，不同型號的FCM是否適用于檢測卷煙煙氣體外微核，檢測結果是否具有一致性仍亟待研究。目前行業內主要選擇中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary cells，CHO）和人支氣管上皮細胞（human bronchial epithelial cells，BEAS-2B）作為卷煙煙氣體外微核試驗的檢測細胞系。CHO細胞為上皮貼壁型細胞，是目前生物工程上廣泛使用的細胞系。Canada Health組織采用CHO細胞作為TPM體外微核試驗的檢測細胞。BEAS-2B（人支氣管上皮細胞）是由美國國立癌癥研究所Harris教授及其同事建系，可用于檢測化學物質和生物制劑的遺傳毒性[14]。由于BEAS-2B 細胞是來源于正常的人支氣管上皮細胞，因此可作為煙氣直接作用的靶細胞，也可作為煙氣安全性生物學評價體外微核試驗的檢測細胞系。因此，本文選擇了多個卷煙樣品，使用以上兩種細胞，在不同類型的FCM上對體外微核自動檢測法進行了比對試驗，旨在對該方法的穩定性和廣泛適用性進行評估，從而為標準方法的制定提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary cells，CHO細胞）購自美國標準生物品收藏中心（ATCC），BEAS-2B細胞來自軍事醫學科學院；In VitroMicroFlow試劑盒購自Litron Laboratory；磷酸鹽緩沖液(PBS)、DMEM/F12培養基、胎牛血清購自Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO，細胞培養級）購自Biomol公司；LHC-8細胞培養基、胰蛋白酶購自Invitrogen公司。

1.2 卷煙樣品

參試卷煙為5種卷煙，其中1種為市售混合型卷煙（1#），1種為肯塔基標準卷煙3R4F（2#），另外3種為市售烤煙型卷煙（3～5#）。

1.3 主要器材和儀器

全自動吸煙機（CERULEAN SM 450）；CO2培養箱（美國Thermo公司）；二級生物安全柜（Heal Force公司）；倒置顯微鏡（TS100-F-HMC，Nikon公司）；96孔板、細胞培養瓶（美國Corning公司）；XS204型分析天平（感量0.0001g，Mettler Toledo公司）；離心機（DT5-5型，北京時代北利離心機有限公司）；流式細胞儀（Quanta SC，Beckman 公司；FACSAriaTMLLU、Accuri C6、FACSCalibur，BD Biosciences公司，具體見表1）。

表1 參與試驗的FCMTab.1 FCM participating in the experiment

1.4 方法

1.4.1 煙氣收集及制備方法

5種卷煙按以下方法進行煙氣捕集：將卷煙在恒溫恒濕箱中平衡48 h，選取重量和吸阻一致的煙支。分別在全自動轉盤式吸煙機上抽吸20支卷煙，用劍橋濾片捕集煙氣的總粒相物。劍橋濾片用DMSO浸泡，超聲提取20 min，最后定容至10 mg/mL，-80 ℃低溫保存備用。

1.4.2 單細胞懸浮液的制備

單細胞懸浮液的制備參照文獻[13]進行，BEAS-2B細胞培養至80%匯合，用0.05%胰蛋白酶溶液消化細胞，再加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，移取細胞懸液至無菌離心管中，于1000 r/min轉速離心5 min。棄上清液，加入LHC-8培養基懸起，形成單細胞懸浮液。計數后用LHC-8培養基稀釋至細胞濃度為（1～2）×105個/mL。

CHO細胞培養至80%匯合，用0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞1 min，再加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，形成單細胞懸浮液。計數后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基稀釋使細胞濃度為（1～2）×105個/mL。

1.4.3 TPM暴露

TPM暴露步驟參照文獻[13]進行，將細胞懸浮液接種于24孔細胞培養板中，接種量為500 μL/孔，培養24 h后移除培養板內的培養基，細胞對照組加入500 μL細胞生長培養基；溶劑對照組加入DMSO，加入量與TPM組最高檢測劑量相當；TPM組加入不同劑量的煙氣樣品，并用DMSO補齊各TPM濃度組，使組內所有孔中的DMSO濃度與溶劑對照組一致。溶劑對照組、陽性對照組和TPM組加入相應的受試物后用細胞生長培養基將孔內溶液體積補足至500 μL，繼續培養24 h。

1.4.4 細胞裂解及染色

細胞裂解及染色參照文獻[13]進行，將細胞培養板置于冰上放置20 min。吸出培養板內的培養基，加入300 μL核酸染料A工作液。保持培養板置于冰上，移開板蓋，在板上方距離大約10～15 cm處放置一白熾燈光源，使樣品暴露于可見光下30 min。移除培養板內的溶液，用1 mL預冷的1×Bu ff er溶液沖洗一次。加入500 μL完全裂解液I，將板置于微孔板振蕩器混合5 s后再加入500 μL完全裂解液II，混合均勻。室溫避光放置30 min后用FCM進行分析。每個樣品統計10,000個細胞核。

1.4.5 流式細胞儀檢測

FCM檢測方法按照文獻[13]中描述進行，具體如下：

1.4.5.1 非核物質排除

圖1a為以前向角（Forward Scatter）和側向角(Side Scatter)作圖。前向角表征細胞核的相對大小，通常依此設置閾值來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒物質。側向角表征細胞核的相對顆粒度，可用于反映胞核內的精細結構。根據前向角和側向角設置細胞核的閾值R1門，以排除非核物質。

圖1 流式細胞儀分析體外微核圖Fig.1 Flow cytometry analysis in vitro micronucleus

1.4.5.2 二聚體細胞核排除

圖1b為以SYTOX的熒光寬度（FL1-W）熒光面積（FL1-A）作圖，熒光寬度常用來區分雙聯體細胞，熒光面積則是采用對熒光光通量進行積分測量，根據以上兩個指標設置R2門，以排除二聚體細胞核及其他非核物質。

1.4.5.3 多倍體細胞核排除

圖1c為以SYTOX的熒光強度（FL1-H）和細胞數量（Counts）作圖，用以觀察細胞周期狀態，雙峰處代表G1、S、G2/M期細胞主核，一般最小的微核熒光強度為細胞主核熒光強度的1/100，因此根據細胞主核及低于主核熒光1/100范圍設置R3門，以排除多倍體的細胞核及其他非核雜質。

1.4.5.4 凋亡小體排除

圖1d和圖1e分別為以SYTOX熒光強度與前向角和側向角作圖，正常的細胞核熒光強度與顆粒大小或顆粒度成線性關系，根據R4門和R5門的設置，可排除熒光強度與顆粒大小或顆粒度成非線性關系的物質，如凋亡小體。

1.4.5.5 死亡細胞核排除

圖1f為以EMA熒光強度（FL3-H）和SYTOX熒光強度作圖。EMA染料是在細胞裂解前加入，從而將凋亡及壞死細胞核染色，設置R6門以排除EMA著色物質如死亡細胞核或凋亡小體。

1.4.5.6 微核率計算

圖1g以SYTOX熒光強度和前向角作圖，通過以上R1-R6的設置，得到的交集為健康的細胞主核及微核群，右上框（R7）為細胞主核物質，左下框（R8）為微核。根據R7和R8門內顆粒計算微核率：

1.4.5.7 數據分析

選用FCM自帶分析軟件或其他合適的流式分析軟件對所獲取的圖像進行分析，統計學數據分析使用SPSS 16.0軟件。用SPSS軟件中的多因素方差分析（樣品、FCM兩個因素）方法，對不同FCM測定的CHO細胞和BEAS-2B細胞的微核率分別進行比較。

2 結果與討論

2.1 不同品牌型號流式細胞儀參數的優化調整及檢測圖比較

圖2為160 μg/mL 1號樣品TPM處理后的CHO細胞體外微核檢測示意圖，FCM1、FCM2、FCM4參與了該細胞的體外微核檢測，由于FCM3所在實驗室不具備CHO細胞培養經驗，因此未參加該細胞的體外微核檢測。

圖2 TPM處理的CHO細胞二元圖Fig. 2 Bivariate plots of TPM-treated CHO cells

圖3為16 μg/mL 1號樣品TPM處理后的BEAS-2B細胞體外微核檢測示意圖，FCM1、FCM2、FCM3參與了該細胞的體外微核檢測，由于FCM4所在實驗室不具備CHO細胞培養經驗，因此未參加該細胞的體外微核檢測。

圖3 TPM處理的BEAS-2B細胞二元圖Fig. 3 Bivariate plots of TPM-treated BEAS-2B cells

流式細胞儀分析細胞核大小及顆粒度的參數使用前向角散射光（FSC）和側向角散射光（SSC）。FCM2、FCM3、FCM4公司的儀器均具有以上檢測指標，FCM1具備SS、FL1、FL3參數，但不具備FSC參數，在試驗中發現用細胞體積（EV）參數可代替FSC參數用于體外微核的分析。由于細胞核的體積小于細胞的體積，因此在進行分析時通常需要調整FSC及SSC的值以使細胞群的位置易于分析，由于不同品牌的FCM在電壓設置上有較大差異，因此無法設定具體的電壓值，通常將細胞群的位置位于分析框的右上角（見圖1a），同時觀察是否有未裂解完全的細胞存在，以保證分析的質量。

本實驗中選用的兩種熒光染料分別為SYTOX Green 和EMA，其中SYTOX Green的激發波長為488 nm，發射波長為523 nm。EMA的激發波長為510 nm，發射波長為610 nm。所有FCM均具備488 nm的激發光源，因此統一選擇488 nm作為激發波長。但不同型號的流式細胞儀配備的光學濾片不同，因此原則是選擇儀器上與染料發射波長較為接近的濾片，具體是FCM1選擇525 nm和575 nm濾片，FCM2選擇530 nm和575 nm濾片，FCM3和FCM4均選擇530 nm和585 nm濾片。

圖1b為以SYTOX的熒光寬度（FL1-W）熒光面積（FL1-A）作圖，從而排除二聚體細胞核及其他非核物質，在操作過程中，FCM1硬件上不具備FL1-W及FL1-A這兩個參數，但是通過與其他的FCM實驗結果進行比對，實際上二聚體細胞核數量較少，并且二聚體細胞核可以通過圖1c排除，其他非核物質可以采用圖1d和圖1e的方式排除，因此對最終的測試結果不存在顯著影響。

參與實驗的FCM的硬件均滿足圖1c～g的分析條件，在實際操作過程中通過調整熒光電壓從而使細胞核主群位于圖像中右上角的位置，一般約在103的坐標位置，圖1c～f門控范圍設置為細胞主核熒光峰及低于主核熒光的1/100，細胞主核熒光應與細胞微核熒光呈線性關系，以避免在排除非核物質及凋亡小體的過程中誤將微核排除。圖1g為最終分析圖，圖中設了兩個門，左上角的門內為健康的細胞主核群，右下方的門內為細胞微核群。

圖2及圖3所示為不同FCM的實際分析圖，由圖可以看出，不同FCM所使用的分析軟件及模版有所差異，如細胞主核及微核所在的位置有所差異，門控的位置及形狀也隨之不一致，但是通過以上的參數調整優化，不同品牌類型的FCM均可利用分析軟件檢測出CHO細胞及BEAS-2B細胞的主核及微核的比例，最終計算微核率。

2.2 流式細胞儀檢測卷煙煙氣體外微核結果

采用2.1中所示的分析方法，對5種TPM處理的細胞分別用FCM進行檢測，并計算出它們的微核率。CHO細胞檢測結果如表2所示，BEAS-2B細胞檢測結果如表3所示，表中所示的微核率均為3次平行試驗的平均值，并根據微核率計算出不同類型FCM間微核率平均值和標準方差。結果表明：兩種細胞的微核率與TPM的處理濃度基本呈劑量反應關系；不同類型FCM在同一細胞上的結果較為一致，說明FCM檢測體外微核方法可在多種類型FCM間重復。

表2 FCM方法檢測出的5種TPM誘導的微核率（CHO細胞）Tab. 2 Detection of 5 types of TPM-induced MN frequencies by FCM (CHO cell)

表3 FCM方法檢測出的5種TPM誘導的微核率（BEAS-2B細胞）Tab. 3 Detection of 5 types of TPM-induced MN frequencies by FCM(BEAS-2B cell)

2.3 不同類型流式細胞儀檢測卷煙煙氣體外微核差異分析

為了研究不同類型FCM對卷煙煙氣誘導的微核率測定值之間是否有顯著差異，利用廣義線性模型（general linear model）對不同FCM間檢測的5種TPM誘導的細胞微核率進行比較。如表4中所示，按0.05顯著性水平，3種類型FCM在CHO細胞上的微核率測定值之間沒有顯著性差異（P=0.053），且5個參比樣品誘導的微核率之間也無顯著性差異（P=0.779）。表5中顯示，3種類型FCM在BEAS-2B細胞上的微核率測定值之間沒有顯著性差異（P=0.131），但是5個參比樣品誘導的微核率之間存在顯著性差異（P=0.000），其中1#樣品（混合型）誘導的微核率高于其他4個樣品，因此可以認為不同類型FCM檢測卷煙煙氣體外微核得出的數據差異無統計學意義，且可以分辨不同樣品引發的微核率差異。

表4 多因素方差分析（CHO細胞)Tab. 4 Multivariate analysis of variance (CHO cell)因變量: 微核率

表5 多因素方差分析（BEAS-2B細胞)Tab. 5 Multivariate analysis of variance (BEAS-2B cell)因變量: 微核率

3 討論

CHO細胞及BEAS-2B細胞的TPM處理濃度是基于多家實驗室對TPM樣品長期檢測的結果，濃度設定基于不超過該樣品在細胞中性紅實驗中CHO得 出 的IC50（The half maximal inhibitory concentration）值，由于BEAS-2B細胞對TPM的敏感性高于CHO細胞[15]，兩種細胞對TPM的IC50相差較大，因此兩種細胞采用不同的TPM濃度梯度處理。檢測結果表明在CHO細胞上參比樣品誘導的微核率之間無顯著性差異，但是在BEAS-2B細胞上參比樣品誘導的微核率之間存在顯著性差異，這進一步印證了BEAS-2B細胞比CHO細胞敏感，所以能檢測出不同樣品間的微小差異。此外，在試驗中發現，BEAS-2B細胞的貼壁性低于CHO細胞，因此在細胞裂解前的處理步驟中操作需要極為輕柔，以免將細胞沖下而導致試驗失敗。

2008年Litron實驗室組織的FCM檢測體外微核共同試驗選用的為小鼠淋巴瘤L5718Y細胞（懸浮細胞），選用的檢測儀器均為BD品牌的FCM，檢測樣品為典型的遺傳毒性物質如絲裂霉素C（MMC）遺傳毒物，依托泊苷，長春新堿等，驗證了FCM可應用于檢測遺傳毒性物質懸浮細胞體外微核的影響[12]。本研究選用的兩種細胞均為貼壁細胞，檢測樣品為5種卷煙樣品的TPM，并且增加了其他品牌的FCM參與檢測，進一步驗證了FCM檢測體外微核的廣泛適用性。

根據參與本次共同試驗的實驗室的長期比對經驗，傳統的顯微鏡檢法檢測卷煙煙氣體外微核的實驗室間RSD值一般在20～30%之間，而本研究中FCM法在2種細胞5種TPM上的的檢測結果間的RSD值基本都在20%之下，說明FCM檢測體外微核方法比普通的顯微鏡檢法更在易于在多家實驗室間重復，數據具有較高的一致性和穩定性。

4 結論

本研究表明，盡管不同品牌類型的FCM檢測參數差異較大，但在調整優化之后均可達到卷煙煙氣體外微核的檢測的技術要求，在5個卷煙樣品，2種不同類型的細胞上使用4種類型FCM檢測卷煙煙氣體外微核獲得的結果一致。

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Comparison study onin vitromicronucleus assay for cigarette smoke fl ow cytometry of different types

GAO Qian1, MIAO Mingming1, LI Xuemei1, YANG Zhihua2, MAO Jian3, Lu Binbin3, ZHENG Saijing4, LIU Jiangjin5，YAO Jianhua1
1 Technology Center of China Tobacco Yunnan Industrial Co., Ltd., Kunming 650106, China;2 Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China;3 Zhengzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corporation, Zhengzhou 450001, China;4 Shanghai Tobacco Group, Shanghai 200082, China;5 China Tobacco Hunan Industrial Co., Ltd., Changsha 410016, China

Objective: This paper was aimed to evaluate the applicability and stability of flow cytometry to detectin vitromicronucleus assay for cigarette smoke. Method: Chinese hamster ovary (CHO) cells and human bronchial epithelial cells(BEAS-2B) were treated with total particulate matter (TPM) from 5 cigarette brands in 4 types FCM，and test data were compared. Results: Parameters varied greatly by different types of FCM and could meet the technical requirements for testing micronucleus induced by TPM after adjustment and optimization. There are no significant differences between micronucleus frequencies of 4 FCM detected (P＞0.05). Conclusion: Different types of FCM were all applicable toin vitromicronucleus testing of cigarette smoke, and test results boasted consistency and stability.

flow cytometry; cigarette smoke total particulate matter; micronucleus

高茜，繆明明，李雪梅，等. 不同類型流式細胞儀檢測卷煙煙氣體外微核比對研究[J]. 中國煙草學報，2016,22（4）

云南中煙工業有限責任公司項目（2015JC02）；中國煙草總公司標準項目（2014QB002）

高 茜（1984—），博士，助理研究員，研究方向為煙草生物學，Tel：0871-68315903，Email:gaoqian840905@163.com

夭建華（1968—），研究員，研究方向為煙草生物學，Tel：0871-65353781，Email: jhyao_2007@126.com

2016-01-08

:GAO Qian, MIAO Mingming, LI Xuemei, et al. Comparison study onin vitromicronucleus assay for cigarette smoke fl ow cytometry of di ff erent types [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(4)