白肋煙煙葉含水率與高溫貯藏過程中TSNA形成的關系

孫榅淑，王俊，許東亞，周駿，白若石，馬雁軍，楊惠娟，焦哲恒，史宏志

1 河南農業大學國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業煙草栽培重點實驗室，河南 鄭州 450002；2 上海煙草集團北京卷煙廠，北京 100024

農藝與調制

白肋煙煙葉含水率與高溫貯藏過程中TSNA形成的關系

孫榅淑1，王俊1，許東亞1，周駿2，白若石2，馬雁軍2，楊惠娟1，焦哲恒1，史宏志1

1 河南農業大學國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業煙草栽培重點實驗室，河南 鄭州 450002；2 上海煙草集團北京卷煙廠，北京 100024

對不同含水率的白肋煙煙葉進行高溫貯藏試驗，并分別向高含水率和低含水率煙葉添加硝酸鹽和亞硝酸鹽后高溫貯藏，測定貯藏前后煙葉的TSNA含量。結果表明：1）經45℃高溫貯藏15 d后，含水率越高的煙葉，TSNA含量越低，含水率超過17.5%后趨于穩定。2）細化梯度試驗中，低含水率煙葉經45℃高溫貯藏15 d后，隨著煙葉含水率從7.7%增加到15.3%，四種TSNA含量和TSNA總量逐漸降低，煙葉含水率高于15.3%后，TSNA總量趨于穩定。3）添加亞硝酸鹽再經60℃高溫貯藏15 d的高含水率煙葉和低含水率煙葉TSNA含量均大幅度增加，而添加硝酸鹽的高含水率煙葉處理TSNA含量增幅較小，低含水率煙葉處理TSNA含量增幅很大，所以低含水率煙葉硝態氮比高含水率煙葉硝態氮更易生成亞硝酸等氮氧化物是造成高溫貯藏過程中TSNAs大量形成的主要原因。研究認為，在保證煙葉不霉變的前提下適當增加貯藏濕度有利于減少貯藏過程TSNAs的形成。

白肋煙；含水率；貯藏；TSNAs

煙草特有亞硝胺(tobacco-speci fi c nitrosamines,TSNAs)是煙草生物堿和亞硝酸發生亞硝化反應生成的存在于煙葉和煙氣中的有害化合物[1-2]。主要有N-亞硝基去甲基煙堿(NNN)、4-(N-甲基-亞硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)和N-亞硝基假木賊堿(NAB)等4種[3]。許多研究表明，調制前的煙葉不含TSNAs或含量極低[4-5]，煙葉中的TSNAs主要在調制和貯藏過程中形成和積累，但目前研究多集中在煙葉調制期間TSNAs的形成。在調制階段，較高的濕度、適宜的溫度及缺氧等條件能促進微生物的生長和繁殖，微生物的活動可使煙葉中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與煙草生物堿反應形成TSNAs[6]。白肋煙調制后的貯藏階段也是TSNA形成的重要時期，溫度和濕度是貯藏環境的兩個主要因素。前期研究結果表明，隨著溫度的增加，白肋煙在貯藏階段TSNA含量大幅度增加[7-8]。Bush等[9]研究發現，貯藏過程中濕度對TSNA形成的影響與煙葉調制過程中濕度的影響截然不同，在貯藏過程中，煙葉TSNA含量在含水量7%～11%的干燥情況下增加最多，煙葉含水量大于20%時TSNA含量幾乎沒有增加。國內白肋煙打葉復烤后煙葉含水率約15%～17%，一般要在庫房中經過2.5～3年的自然陳化，因此環境溫度和濕度對煙葉貯藏條件影響很大，夏季高溫季節貯藏溫度可達45℃以上，干旱季節煙葉含水率可在10%以下，貯藏環境可直接影響煙葉TSNAs的形成。為了進一步研究煙葉含水率對高溫貯藏過程中TSNA形成的影響和機理，設置不同含水率煙葉的高溫貯藏試驗，以明確可以有效降低TSNA含量的煙葉含水率參數。在另一個試驗中，分別向低含水率煙葉和高含水率煙葉人為添加硝酸鹽和亞硝酸鹽，得到了硝酸鹽、亞硝酸鹽含量較高的煙葉，并進行高溫貯藏，探討不同含水率煙葉在分別添加硝酸鹽和亞硝酸鹽后TSNA增加的效應。該研究旨在揭示貯藏過程中煙草特有亞硝胺的形成機理，可為減少貯藏階段TSNA形成提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為白肋煙中部葉，煙葉品種為TN86，試驗1所用煙葉于2012年在云南云龍種植，試驗2所用煙葉于2012年在云南賓川種植，試驗3所用煙葉于2013年在云南賓川種植，調制方法均為晾房晾制。將煙葉去除主脈后，剪成0.5 cm2大小的碎片，充分混勻放入冰箱待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 對貯藏前的煙葉取樣

以下每個試驗進行之前，均取20 g煙葉樣品，冷凍干燥后磨碎，過60目篩，測定樣品高溫貯藏前的TSNA含量。

1.2.2 不同含水率煙葉（試驗1）

基于在一定溫度下密閉空間內的飽和鹽溶液能使空氣濕度恒定的特性，試驗中空氣濕度通過裝有飽和鹽溶液的密封干燥皿來控制。在24.5℃的密閉環境中，飽和K2CO3溶液能使空氣濕度保持在43%，通過控制其濃度來調節空氣濕度。煙葉含水率試驗設5個處理，在5個干燥皿中分別加入飽和K2CO3溶液、3/4飽和K2CO3溶液、1/2飽和K2CO3溶液、1/4飽和K2CO3溶液、蒸餾水各300 mL，每個處理稱20 g煙葉用報紙包起來放在干燥皿的瓷板上，密封干燥皿。將干燥皿置于24.5℃培養箱中處理4 d后測得煙葉相對含水率分別為7.71%、11.23%、17.53%、25.12%、31.52%。然后將含水率恒定的煙葉分別轉移至玻璃閃爍計數瓶中置于45℃培養箱貯藏15 d。每一處理設3次重復。

1.2.3 細化梯度的低含水率煙葉（試驗2）

由于含水率高的煙葉不宜長期貯存，進一步細化濕度梯度，設6個處理，溶液分別為飽和K2CO3溶液、9/10飽和K2CO3溶液、8/10飽和K2CO3溶液、7/10飽和K2CO3溶液、6/10飽和K2CO3溶液、1/2飽和K2CO3溶液各300 mL，其它方法同上，將干燥皿置于24.5℃培養箱中處理4 d后煙葉相對含水率分別為7.71%、8.90%、9.93%、12.30%、15.30%、17.53%。將含水率恒定的煙葉分別轉移至玻璃閃爍計數瓶中，置于45℃培養箱貯藏15 d。每一處理設3次重復。

1.2.4 低含水率煙葉和高含水率煙葉人為添加硝酸鹽和亞硝酸鹽（試驗3）

低含水率煙葉中添加硝酸鹽和亞硝酸鹽試驗設3個處理，每個處理20 g煙葉，處理1噴10 mL清水，處理2將1 g NaNO3溶解于10 mL清水中噴在煙葉上，處理3將0.1 g NaNO2溶解于10 mL清水中噴在煙葉上。噴過清水和鹽溶液的各處理煙葉含水率較高，晾于15℃，相對濕度為60%的環境中12 h后煙葉含水率有所降低，用飽和K2CO3溶液平衡水分4 d后煙葉的相對含水率為7.71%。高含水率煙葉中添加硝酸鹽和亞硝酸鹽試驗設3個處理，方法同上，處理后煙葉用1/2飽和K2CO3溶液平衡水分4天后煙葉的相對含水率為17.53%。6個處理煙葉分別轉移至玻璃閃爍計數瓶中置于60℃培養箱貯藏15 d。

將所有樣品冷凍干燥，磨碎后過60目篩。每個處理設3次重復。

1.3 TSNA含量測定

所有樣品均送至上海煙草集團北京卷煙廠進行測定，應用在線SPE-液相色譜質譜聯用（SPE-LC-MS/MS）法[10]，即將煙樣全自動固相萃取，萃取液過水相濾膜后使用LC-MS/MS進行檢測。

2 結果與分析

2.1 煙葉含水率對白肋煙高溫貯藏過程TSNA形成的影響

由表1結果可知，高溫貯藏后各處理煙葉的4種TSNA含量及TSNA總量遠高于貯藏前。高溫貯藏的不同處理間TSNA總量存在較大差異，煙葉含水率為7.71%時TSNA總量最高，隨著煙葉含水率的增大，白肋煙貯藏過程TSNA總量逐漸下降，煙葉含水率增大到17.53%后再繼續增大，TSNA總量趨于穩定，降低幅度較小。除了含水率為25.12%和31.52%的兩處理之間差異不顯著外，其它處理之間均有顯著差異。

高溫貯藏條件下含水率為7.71%的處理NNN、NAT、NNK的含量均最高，且隨著煙葉含水率的增大而逐漸降低，增大到17.53%后再繼續增大，3種TSNA含量降低幅度減小或不再降低。不同含水率的煙葉NAB含量存在較大差異，煙葉含水率為11.23%時NAB含量最高，為25.12%時NAB含量最低，無明顯規律。

表1 不同含水率白肋煙45℃貯藏15 d后的TSNA含量Tab.1 TSNA contents in burley tobacco leaves with different moisture content after 45℃ storage for 15 d μg·g-1

2.2 細化梯度的煙葉含水率對白肋煙高溫貯藏過程TSNA形成的影響

高溫貯藏前未平衡水分的煙葉含水率為13.60%，其NNN、NAT、NAB、NNK的含量分別為0.5649，0.5969，0.0111，0.0354，TSNA總量為1.2083。圖1和圖2為細化含水率梯度的白肋煙45℃高溫貯藏15 d后的TSNA含量。高溫條件下貯藏的不同含水率的煙葉TSNA含量均顯著高于貯藏前，這和前期研究的溫度對白肋煙貯藏過程中TSNA形成的影響的結果一致。在同樣的高溫貯藏條件下，隨著煙葉含水率從7.71%增加到15.30%，4種TSNA含量及TSNA總量逐漸降低。當煙葉含水率高于15.30%時，TSNA總量趨于穩定。

圖1 細化含水率梯度的白肋煙45℃貯藏15 d后TSNA含量Fig. 1 TSNA contents in burley tobacco leaves with detailed gradient moisture content after 45℃ storage for 15 d

圖2 細化含水率梯度的白肋煙45℃貯藏15 d后TSNA總量Fig. 2 Total TSNA content in burley tobacco leaves with detailed gradient moisture content after 45℃ storage for 15 d

2.3 不同含水率煙葉中添加硝酸鹽和亞硝酸鹽對其高溫貯藏過程中TSNA形成的影響

高溫貯藏前煙葉的含水率為13.60%，其NNN、NAT、NAB、NNK含量及TSNA總量的測定結果分 別 為 0.9835，1.7329，0.0338，0.0661，2.8163。60℃高溫貯藏15 d后各處理煙葉的4種TSNA含量及TSNA總量如圖3～圖4所示。高溫貯藏后噴清水對照煙葉的TSNA含量是貯藏前的數十倍，低含水率對照煙葉TSNA總量是高含水率對照煙葉的2.32倍。高溫貯藏后，噴硝酸鹽的高含水率煙葉TSNA含量與噴清水對照相比有少量增加，噴亞硝酸鹽的煙葉TSNA含量大幅度增加。低含水率煙葉噴硝酸鹽的效果與高含水率煙葉不同，4種TSNA含量和TSNA總量大幅度增加，噴亞硝酸鹽的煙葉TSNA含量與噴清水對照相比的增加量大于噴硝酸鹽的增加量。

圖3 噴施硝酸鹽和亞硝酸鹽的不同含水率煙葉60℃貯藏15 d后4種TSNA含量Fig. 3 TSNA contents in burley tobacco leaves added with nitrate and nitrite at different moisture contents after 60℃ storage for 15 d

圖4 噴施硝酸鹽和亞硝酸鹽的不同含水率煙葉60℃貯藏15 d后TSNA總量Fig. 4 Total TSNA content in burley tobacco leaves added with nitrate and nitrite at different moisture contents after 60℃ storage for 15 d

3 討論

試驗結果表明，45℃高溫貯藏后煙葉中TSNA含量均遠高于貯藏前，隨著含水率的增加，煙葉TSNA增加量減小。煙葉含水率增大到17.5%后再繼續增大，TSNA總量趨于穩定，這和Bush研究的結果一致。在45℃的高溫貯藏條件下，進行細化含水率梯度試驗，隨著煙葉含水率從7.7%增加到15.3%，4種TSNA含量和TSNA總量的增加量逐漸降低。高含水率和低含水率的白肋煙中人為添加亞硝酸鹽并于60℃高溫貯藏15 d后TSNA含量均大幅度增加。高含水率的白肋煙人為添加硝酸鹽后，60℃高溫貯藏過程TSNA含量有少量的增加，而低含水率的白肋煙人為添加硝酸鹽后，高溫貯藏過程TSNA含量大幅度增加。這可能是由于在高濕條件下硝酸鹽是水溶態的，而在低濕條件下硝酸鹽更利于揮發出氣體氮氧化物[11-12]，與生物堿生成煙草特有亞硝胺。Shi等[8]和Verrier等[13]研究表明，在一定濕度條件下，隨著貯藏溫度的升高，煙葉TSNA含量顯著升高，特別是貯藏溫度超過27℃時更甚。因此，煙葉含水率控制在17%以上，貯藏溫度控制在27℃以下的低溫高濕貯藏可有效減少貯藏過程TSNA形成。在生產上貯藏溫度過低會使煙葉發酵不充分，而貯藏濕度過高煙葉霉菌繁殖快，易于霉變，且貯藏過程中容易細胞破裂而“出油”，粘結成塊，氧化變黑，會影響煙葉的外觀質量和感官質量[5]。因此在控制煙葉含水率保證煙葉不發生霉變，溫度能保障煙葉正常發酵的前提下，適當降低貯藏溫度，增大煙葉含水率可以有效地降低白肋煙貯藏過程中TSNAs的積累。

4 結論

在高溫貯藏條件下，煙葉含水率對貯藏過程中TSNA形成有重要影響。高溫貯藏后煙葉中TSNA含量遠高于貯藏前，含水率高的煙葉TSNA增加量相對較小。低含水率煙葉硝態氮比高含水率煙葉硝態氮更易生成亞硝酸等氮氧化物是造成高溫貯藏過程中TSNAs大量形成的主要原因。

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The relationship between moisture content and TSNA formation in burley tobacco during high temperature storage

SUN Wenshu1, WANG Jun1, XU Dongya1, ZHOU Jun2, BAI Ruoshi2, MA Yanjun2, YANG Huijuan1, JIAO Zheheng1, SHI Hongzhi1
1 National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center, Tobacco Cultivation Key Laboratory of China Tobacco, Zhengzhou 450002, China;2 Beijing Cigarette Factory, Beijing 100024, China

Burley tobacco leaves with varied moisture content levels were stored at high temperature environment. Burley tobacco leaves with high and low moisture content were stored at high temperature environment after adding nitrate and nitrite separately. All samples before and after high temperature storage were measured for TSNAs. Results indicated that the TSNA contents decreased with the increment of moisture content after 45℃ storage for 15 d. While moisture content was higher than 17.5%, the total TSNA content tended to be stable. After 45℃ storage for 15 d, four individual TSNA content and the total TSNA content in burley tobacco with detailed moisture content decreased as the moisture content increased from 7.7% to 15.3%. While the moisture content was higher than 15.3%, the total TSNA content tended to be stable. After 60℃ storage for 15 d, nitrite sprays caused a very marked increase of TSNA contents in both the low and high moisture tobaccos, nevertheless, nitrate sprays caused a much smaller increase of TSNA contents in the high moisture tobacco but a signi fi cant increase in the low moisture tobacco. Nitrate more easily produced nitrite and other gaseous NOx in low moisture tobacco than high moisture tobacco during high temperature storage was the main reason for increased TSNA formation. Proper increase of the moisture content of cured tobacco would be e ff ective pathways to reduce TSNA formation during high temperature storage.

burley tobacco; leaf moisture; storage; TSNAs

孫榅淑，王俊，許東亞，等. 白肋煙煙葉含水率與高溫貯藏過程中TSNA形成的關系 [J]. 中國煙草學報，2016,22（4）

國家煙草專賣局減害重大專項項目：110201301022（JH-03）

孫榅淑（1990—），在讀碩士研究生，主要從事煙草栽培生理研究, Email：swssdd123@163.com

史宏志（1963—），博士，教授，博士生導師，主要從事煙草栽培生理研究，Email: shihongzhi88@163.com

2015-07-06

:SUN Wenshu, WANG Jun, XU Dongya, et al. The relationship between moisture content and TSNA formation in burley tobacco during high temperature storage [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(4)