兩個煙草Nup96基因的分子克隆及其表達分析

林世鋒，王仁剛，史躍偉，張孝廉，鄒頡，任學良，余婧

貴州省煙草科學研究院，煙草行業分子遺傳重點實驗室，貴州貴陽龍灘壩路29號 550081

兩個煙草Nup96基因的分子克隆及其表達分析

林世鋒，王仁剛，史躍偉，張孝廉，鄒頡，任學良，余婧

貴州省煙草科學研究院，煙草行業分子遺傳重點實驗室，貴州貴陽龍灘壩路29號 550081

為研究煙草低溫早花的分子機理，采用RT-PCR結合RACE法，從煙草品種NC82中克隆到2個Nup96基因cDNA全長序列，分別命名為NtNup96a和NtNup96b，GenBank登陸號分別為KU558693和KU558694。序列分析表明2個基因均編碼1037個氨基酸殘基的蛋白，氨基酸序列一致性為97%，與擬南芥Nup96蛋白（NP_178183）的序列一致性為60%；2個基因編碼蛋白具有典型的植物Nup96結構特性，包含1個Nup96結構域和1個自酶解結構域。熒光定量PCR分析表明：在正常的生長條件下，NtNup96a和NtNup96b在煙草各組織中均有表達，在葉片中的表達量較弱，且隨著植株生長其表達量顯著下降；在

12℃處理10天后，在煙草葉片中2基因的表達都出現了明顯的下調，這一結果提示Nup96可能是煙草開花時間調控的抑制因子，其受低溫誘導下調表達可能與NC82低溫敏感，易早花特性相關。

煙草；Nup96；基因克隆；表達分析

煙草是一種喜溫的葉用經濟作物，在煙葉生產過程中時常發生早花現象，煙草早花會造成煙葉產量和品質的嚴重下降。低溫是導致煙草早花的主要原因之一，早花發生規律研究結果說法不一，其確切的分子機制尚不明了[1]。

近些年，隨著擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）等模式植物全基因組序列測定完成，植物成花誘導分子機制研究也取得了一定進展[2]。植物成花過程受溫度、光和激素等許多因素影響，已明確高等植物的7條成花誘導途徑，即春化途徑、溫敏途徑、光周期途徑、赤霉素（gibberellin，GA）途徑、自主途徑、成花抑制途徑和年齡途徑[2]。擬南芥核膜孔蛋白Nup96，又稱為SUA41/MOS3/SAR3[3]，通過調節mRNA等物質的核輸出，參與擬南芥的基本防御和組成型抗性反應[4]，并且在植物激素信號傳導和植物發育中發揮重要作用[5-6]，突變體具有顯著早花表型[7]。2013年，黃國文等[8]研究表明，Nup96作為開花抑制因子，參與調節擬南芥開花關鍵基因的表達，在開花自主途徑和溫敏途徑中起作用，并且在溫敏途徑的功能更明顯。目前，有關植物Nup96的研究僅在擬南芥中有相關報導，其它植物中尚未見研究報道。本研究克隆了煙草的兩個Nup96基因NtNup96a和NtNup96b，并分析了兩個基因在低溫處理條件下的表達，為進一步研究它們在煙草低溫早花發生過程中的分子調控機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以對低溫敏感的煙草品種NC82（Nicotiana tabacumL. cv. NC82）為材料，采用漂浮育苗，煙苗3～4片真葉時移栽至花盆中培養。煙株生根期和旺長期分別采集煙株根、莖、葉，液氮速凍，-80℃保存備用。對于低溫處理實驗的幼苗，待8片真葉期選取6株生長一致的煙苗移入智能人工氣候箱中（光周期12 h/12 h，濕度60%），其中3株進行12℃低溫處理10d，另外3株不做低溫處理，分別采集低溫處理和未低溫處理煙苗葉片，液氮速凍，-80℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成

采用Invitrogen公司的Trizol試劑盒提取總RNA。cDNA第一鏈的合成按照TaKaRa公司的PrimeScriptTMⅡ 1 st strand cDNA Synthesis Kit說明書進行操作。

1.2.2 Nup96全長cDNA的克隆

以擬南芥Nup96蛋白氨基酸序列（登陸號：NP_178183）為探針，在煙草EST數據庫中進行同源搜尋，發現與之相似的煙草EST，經拼接獲得重疊群。依據上述信息設計基因3′和5′ RACE反應的特異性引物（表1）。 采用SMARTTMRACE cDNA Ampli fi cation Kit（TaKaRa公司）擴增基因的3′和5′末端。將3′和5′末端測序結果與EST重疊群序列進行比對拼接，得到基因全長cDNA序列信息，設計全長引物（表1），以cDNA為模板進行擴增和測序驗證。

1.2.3 Nup96基因組序列克隆

煙草基因組DNA采用CTAB法[9]提取。利用全長引物對基因組DNA進行PCR擴增、克隆和測序。

表1 引物序列和擴增片段長度Tab.1 Sequence of primers and preproduction length

1.2.4 生物信息學分析

在http://www.ncbi.nlm.nih.gov上利用BLAST工具和ORF Finder工具對全長cDNA序列進行序列比對和開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）預測；采用DNAMAN 6.0軟件進行多重序列比對和基因結構分析，并利用ClustalX 2.0及MEGA4.0軟件包的Neighbor-Joining方法構建系統進化樹。

1.2.5 熒光定量PCR

根據NtNup96a和NtNup96b的cDNA序列設計PCR引 物N1-rF和N1-rR、N2-rF和N2-rR， 以 煙草β-actin作為內參基因[10]，PCR引物Actin-rF和Aactin-rR序列見表1。按照TaKaRa公司Taqman探針試劑盒說明書，利用ABI Stepone Plus實時熒光定量PCR儀進行擴增，分析NtNup96a和NtNup96b在煙草不同時期、不同組織及低溫處理條件下的表達。

2 結果與分析

2.1 NtNup96a和NtNup96b全長cDNA克隆及分析

以NP_178183為探針序列，在煙草EST庫中進行電子延伸，得到2個基因重疊群。通過3′和5′RACE，獲得2個基因3′和5′末端序列（圖1擴增條帶6和5）。通過測序拼接，RT-PCR擴增獲得2個基因全長cDNA序列（圖1擴增條帶3和7），分別命名為NtNup96a和NtNup96b，GenBank注冊號為KU558693和 KU558694。NtNup96a基 因 cDNA全長3635 bp（不包含多聚腺苷酸尾），編碼區長3114 bp，編碼1037個氨基酸，預測分子量約為117.732 kDa，等電點為4.99；NtNup96b基因cDNA全長3545 bp，編碼區長3114 bp，編碼1037個氨基酸，預測分子量約為117.590 kDa，等電點為4.88（圖2）。

圖1 煙草NtNup96a/b基因的PCR擴增結果Fig.1 PCR ampli fi cation results of NtNup96a/b from Nicotiana tabacum

圖2 煙草中NtNup96a和NtNup96b氨基酸序列比較Fig. 2 Amino acid sequence alignment of the NtNup96a/b proteins

同源性分析表明，煙草NtNup96a和NtNup96b2個基因之間的氨基酸序列一致性為97%，它們與已報道的擬南芥AtNup96基因（NP_178183）的氨基酸序列一致性為60%。與其它植物同類基因的氨基酸序列一致，除具有典型的Nup96結構域之外，在其N端還有一個脊椎動物Nup98蛋白特有的“自酶解結構域”（Autoproteolytic domain，APD），見圖2。

系統發生樹分析表明（圖3），同科植物在進化樹上基本處于同一分支。NtNup96a與絨毛狀煙草的親緣關系最近，NtNup96b與林煙草的親緣關系最近，絨毛狀煙草和林煙草是栽培煙草的兩個祖先種，推測NtNup96a源于絨毛狀煙草基因組，NtNup96b源于林煙草基因組，絨毛狀煙草和林煙草雜交加倍的過程中各貢獻了1個Nup96基因同源拷貝，栽培煙草基因組中有兩個拷貝發揮著生物學功能。

圖3 植物 Nup96蛋白的聚類及基因結構比較Fig. 3 Phylogenetic structure of Nup96 protein in plants

2.2 NtNup96a和NtNup96b基因組序列分析

采用NtNup96a和NtNup96b的全長擴增引物從煙草基因組中克隆到了NtNup96a和NtNup96b對應的基因組序列，并將序列提交到NCBI，獲得GenBank登陸號分別為KU558695和KU558696。NtNup96a和NtNup96bDNA全長分別為5593 bp和5546 bp。將DNA序列與基因cDNA序列進行比對，結果表明，NtNup96a含有5個內含子，NtNup96b含有4個內含子，這些內含子均符合標準的GT-AG剪切規則。由圖3可知，Nup96基因在高等植物中具有相似的結構特征，在編碼區外顯子基本一致，內含子的相對位置也是保守的，只是長度有所變化，推測可能是由于內含子在進化上高度活躍所致。

2.3 NtNup96a和NtNup96b基因的時空表達模式分析

通過實時熒光定量PCR檢測NtNup96a和NtNup96b基因的時空表達模式，發現2個基因在不同發育時期的煙草根、莖、葉等器官中都有表達，其中葉片的表達量略低，且表達量在葉片生長過程的變化幅度較大（圖4）。

圖4 熒光定量PCR分析NtNup96a和NtNup96b基因時空表達特性Fig. 4 Temporal-spatial expression analysis of NtNup96a and NtNup96b by real-time PCR

與對照相比，12℃低溫處理10 d的煙草葉片2個基因的表達量明顯下調（圖5），下調倍數分別為5.43和3.64，說明NtNup96a和NtNup96b基因可能參與了煙草幼苗低溫脅迫應答反應。

圖5 低溫處理對NtNup96a和NtNup96b基因表達水平的影響Fig. 5 Effect of low temperature on expression of NtNup96a and NtNup96b

3 結論與討論

通過RT-PCR結合RACE技術，克隆了2個煙草Nup96基因的全長cDNA，根據核苷酸序列推導出的氨基酸序列與已報到的擬南芥Nup96基因的氨基酸序列一致性為60%。基因結構分析表明，NtNup96a和NtNup96b基因在編碼區由1大4小的5個外顯子組成，其編碼的氨基酸序列具有植物Nup96典型的結構特點，如Nup96結構域、N端保守的APD結構域及其C末端保守的酶切位點氨基酸殘基。因此推測2個基因編碼的蛋白屬于Nup96蛋白家族成員。

溫度是影響植物開花的重要環境因素，對于外界溫度的誘導，植物不同物種的開花時間表現不同，體現了不同植物對自然環境的特殊適應性，例如將模式植物擬南芥的生長溫度從16 ℃提高到23 ℃，會誘導其早開花，這種高溫誘導開花與其成花素基因FT的表達上調一致[11-13]。與這種現象相反，高溫抑制菊花（Chrysanthemummorifolium）開花，當夏季平均溫度大于20 ℃時會導致菊花晚開花，這種晚開花的現象和菊花在高溫度條件下FT同源基因的表達削弱有直接的關系[14-15]。可以看出，溫度對擬南芥和菊花開花時間的作用效果相反，FT基因作為開花促進因子在兩種植物中受高溫誘導表現出相反的表達趨勢。黃國文等[7]研究表明，與22 ℃相比，16 ℃低溫顯著誘導擬南芥Nup96基因的上調表達，確定Nup96是擬南芥開花時間調控中的抑制因子，抑制擬南芥開花。就煙草而言，低溫誘導煙草早花，本研究根據以往研究結果[16-18]，選擇12 ℃ 10 d低溫處理8葉期的NC82煙苗，采用定量PCR方法分析溫度對煙草Nup96基因表達水平的影響，結果顯示12 ℃低溫處理顯著誘導煙草Nup96基因的下調表達，表現出與擬南芥完全相反的變化趨勢。鑒于溫度對擬南芥和煙草開花時間的作用效果相反，推測Nup96是煙草開花時間調控的抑制因子，其受低溫誘導下調表達可能與NC82低溫敏感，易早花特性相關。

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Molecular cloning and expression analysis of twoNup96genes inNicotiana tabacumL.

LIN Shifeng, WANG Rengang, SHI Yuewei, ZHANG Xiaolian, ZOU Jie, REN Xueliang, YU Jing
Guizhou Academy of Tobacco Science, Key Laboratory of Molecular Genetics, China National Tobacco Corporation,Guiyang 550081, China

Two full-length cDNAs encoding di ff erent Nup96s were cloned fromNicotiana tabacumL. cv. NC82 by RT-PCR and SMART RACE technology, and were designated asNtNup96a(GenBank accession Number KU558693) andNtNup96b(GenBank accession Number KU558694), respectively. Sequencing analysis indicated that they were 97% identical to each other at the amino acid sequence level and shared 60% identity withArabidopsis thalianaNup96 (NP_178183), respectively. The predicted proteins of them shared typical characteristic of Nup96 in plants, containing a conserved Nup96 domain and a conserved autoproteolytic domain. Expression analysis showed thatNtNup96aandNtNup96b were detected in all tissues, and their expressions were the lowest in leaves and decreased with the increase of plant age. After cold treatment at 12 ℃ for 10d, the expression of both genes declined signi fi cantly in leaves, which suggested thatNtNup96aandNtNup96bmight be inhibitory factors in the regulation of fl owering time in tobacco and were involved in low temperature response and early fl owering of cold-sensitive tobacco NC82.

Nicotiana tabacumL.; Nup96; gene cloning; expression analysis

林世鋒，王仁剛，史躍偉，等. 兩個煙草Nup96基因的分子克隆及其表達分析[J]. 中國煙草學報，2016, 22（4）

中國煙草總公司重點項目（110201302004）；中國煙草總公司貴州省公司科技項目（2011-3047）；煙草行業分子遺傳重點實驗室專項經費課題（110201403018）

林世鋒（1978—），博士，副研究員，主要研究方向為煙草遺傳育種與分子生物學，Tel：0851-84116968，Email：linshifeng1978@163.com

余婧（1983—），碩士，助理研究員，主要研究方向為煙草分子生物學，Tel：0851-84116968，Email：yujingbio@126.com

2016-03-22

：LIN Shifeng, WANG Rengang, SHI Yuewei, et al. Molecular cloning and expression analysis of twoNup96genes inNicotiana tabacumL. [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(4)