超聲波提取羊耳菊黃酮類化合物的工藝研究

楊　敏，劉孟吉

（吉林農業科技學院，吉林　吉林　132001）

超聲波提取羊耳菊黃酮類化合物的工藝研究

楊敏，劉孟吉

（吉林農業科技學院，吉林吉林132001）

為了研究羊耳菊最佳工藝，試驗采用超聲的方法來提取羊耳菊中黃酮類化合物，確定最佳的提取工藝條件。試驗采用單因素和正交試驗，分析乙醇濃度、料液比、提取時間及提取溫度等四個因素對黃酮類化合物含量的影響，優化提取工藝條件。結果表明：乙醇濃度60%，料液比為1：10、提取時間為10min、提取溫度為60℃，黃酮含量可以達到69.82mg/g。優選提取工藝簡單可行，速度快，可提高葛花人參中有效成分的收率。

羊耳菊；超聲波；黃酮類化合物；提取工藝

羊耳菊（Inula cappa（Buch-Ham）DC.），系菊科旋覆花屬植物，亞灌木，根狀莖粗壯［1］。具有除風散寒，行氣止嘔，止汗，止瀉，止血的功效。臨床上用于治療感冒發燒、喉炎、咳嗽咳血、虛癆、心悸、月經不調及產后流血等癥，療效肯定，具有很高的研究開發價值［2］。其主要化學成分為黃酮類化合物。黃酮類化合物因其結構和來源的不同，溶解性差異也很大，因此應根據其極性和溶解性來選擇合適的提取溶劑［3］。本試驗采用超聲提取方法，以黃酮類化合物的含量主要考察指標，采用正交試驗法探討了不同提取條件對黃酮含量的影響，為羊耳菊抗炎活性藥理研究奠定了基礎。

1　材料與儀器

1.1材料

羊耳菊在吉林大藥房購買，由武曉琳老師鑒定為羊耳菊。

蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所供紫外法含量測定用）；95%乙醇溶液 （天津市光復科技發展有限公司）；氫氧化鈉（分析純）；亞硝酸鈉（分析純）；硝酸鋁（分析純）

1.2儀器

766-2型遠紅外輻射干燥箱 （南通科學儀器廠）；ALC-310電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；LG-08A型高速萬能粉碎機 （天津市泰斯特儀器有限公司）；試驗篩（新鄉市同心機械有限責任公司）；UY-1700紫外可見分光光度計 （日本島津）；SHB-III型循環水式多用真空泵 （鄭州長城科工貿有限公司）；SY-360超聲波清洗機（上海寧商超聲儀器有限公司）。

2　試驗方法

2.1工作曲線回歸方程的建立

將蘆丁干燥至恒重，制成標準樣品，精密稱取蘆丁10mg，用60%的乙醇溶解并稀釋至50mL。作為蘆丁標準液。精密量取0，1，2，3，4，5mL蘆丁標準液，分別置100mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，混勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶 1mL，混勻，放置6min，加氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以試劑空白作參比，用分光光度法分別在500nm處測定吸光度，繪制標準曲線。

2.2羊耳菊中黃酮類化合物的提取

2.2.1提取物的制備

準確稱取羊耳菊粉末4g，加入60%乙醇溶液80mL，在溫度為60℃、頻率35KHZ、功率360W的情況下提取15min，減壓抽濾，將濾液轉移至100mL容量瓶中定容至刻度，備用。

2.2.2樣品黃酮含量測定

精確量取0.5mL樣品液至25mL容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液1mL，搖勻，放置6min，加10% Al（NO3）3溶液1mL，搖勻，放置6 min，加4%NaOH溶液10mL，然后用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min。用分光光度法在波長為500nm處測定吸光度，根據回歸方程計算樣品中黃酮類化合物含量［4］。

2.3單因素試驗

2.3.1乙醇濃度對黃酮提取效果的影響

改變乙醇溶液濃度其他條件不變，分別加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液80ml進行提取，測定吸光度值，計算黃酮含量。

2.3.2料液比對黃酮提取效果的影響

改變料液比其他條件不變，用不同的料液比（1：3、1：6、1：9、1：12、1：15）進行提取，測定吸光度值，計算黃酮含量。

2.3.3超聲波提取時間對黃酮提取效果的影響

改變提取時間其他條件不變，分別提取10min、15min、20min、25min、30min。測定吸光度值，計算黃酮含量。

2.3.4超聲波提取溫度對黃酮提取效果的影響

改變提取溫度其他條件不變，分別用提取溫度為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃進行提取，測定吸光度值，計算黃酮含量。

2.4正交試驗

以乙醇為浸提溶劑，采用超聲波提取法，設計正交實驗考察溶劑濃度、提取時間、料液比、溫度這4個因素，每個因素取3個水平，以黃酮含量為考察標準，優選出最佳提取條件。選L9（34）作正交試驗，統計試驗結果。

3　結果與分析

3.1蘆丁標準曲線的制作

用Excel軟件進行線性回歸分析，得線性回歸方程，繪制蘆丁濃度C與吸光度的標準曲線。測得值最小二乘法進行線性回歸，分析得回歸方程y= 1.0412x+6.1×10-3，相關系數R2=0.9993，說明其線性關系良好。

3.2單因素試驗結果

3.2.1乙醇濃度對黃酮提取影響結果

圖1　乙醇濃度對總黃酮提取的影響曲線

由圖1可見總黃酮含量隨著乙醇濃度增加而逐漸增長，但當乙醇濃度達到60%時黃酮提取率反而降低。這是因為隨著乙醇濃度的增大，會使提取品中雜質含量增加，有效成分含量反而降低，影響提取物有效含量。所以設計正交試驗乙醇濃度三個水平為50%、60%、70%。

3.2.2料液比對黃酮提取的影響結果

圖2　料液比對黃酮提取的影響

由圖2可以看到黃酮含量隨料液比增加變化不大，極差僅為0.81，料液比在1：25時黃酮含量最高。所以將料液比不作為考察因素，將其作為空白組。考慮實際操作中料液比過小時，提取劑太少不利于過濾分離，提取劑太多過濾時間太長。所以選擇料液比在1：9。

3.2.3超聲波提取時間對黃酮提取的影響結果

圖3　提取時間對黃酮提取的影響

由圖3可知10～15min時黃酮含量增加明顯，之后黃酮含量變化不大。由此可以看出，15min之后再延長提取時間對黃酮含量影響不大。造成提取物在超聲作用達到一定時間后，黃酮含量增加緩慢或呈下降趨勢的原因可能是在長時間超聲作用下，黃酮含量逐漸向極限值靠近，致使提黃酮含量增幅降低。同時超聲作用時間太長，會使提取粗品中雜質含量增加，有效成分含量反而降低，影響提取物有效含量。所以選擇提取時間為10、15、20min為正交試驗的三個水平。

3.2.4超聲波提取溫度對黃酮提取的影響結果

圖4　超聲波提取溫度對黃酮提取的影響

有圖4可見當溫度在60℃時黃酮含量達到最大值，之后黃酮含量反而降低。這可能是因為隨著溫度的提高，雜質的溶出也相應增加，致使黃酮含量的提取逐漸降低。所以選擇50、60、70℃為正交試驗的三個水平。

3.3正交試驗結果分析

由單因素試驗可看出料液比對黃酮含量影響不大，因此將料液比作為空白組。即以乙醇濃度（因素A）、提取時間（因素B）、提取溫度（因素C）進行正交試驗設計，同時對實驗結果分析，因素水平安排表見表1，正交試驗設計及結果見表2。

表1　正交試驗因素與水平安排表

表2　正交試驗設計及結果

通過正交試驗和數據處理（表3）考慮A、B、C三因素在三個水平上的變化，得出最佳提取條件，由極差分析可以看出，影響提取羊耳菊中黃酮類化合物含量的因素主次順序為A＞C＞B。從平均黃酮含量看，A2B1C2提取條件最好，即乙醇濃度為60%、提取時間為10min、提取溫度為60℃的時候提取條件最好。

表3　方差分析

由表3方差分析可知，乙醇濃度對實驗結果的影響非常顯著，提取溫度對黃酮含量比較顯著。由此得出結論3種因素顯著性的強弱依次為：乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間。因此提取條件最好，即乙醇濃度為60%、提取時間為10min、提取溫度為60℃的時候提取條件最好。

3.4最佳工藝試驗驗證

取三份羊耳菊粉末各4.00g，按照最佳提取條件平行操作測定吸光度，并計算平均黃酮含量為67.32mg/g，3次實驗結果經計算RSD=0.797%。實驗工藝條件重現性好，因此以正交實驗確定的最優組合為最佳提取工藝條件，見表4。

表4　驗證試驗

4　結論

本實驗是以羊耳菊為原料，利用超聲波對黃酮類化合物提取工藝進行研究。通過單因素試驗和正交試驗設計考察不同因素對羊耳菊提取液中黃銅類化合物含量的影響。最佳工藝條件為：乙醇濃度為60%，料液比為1：9、提取時間為10min、提取溫度為60℃，黃酮含量可達69.82mg/g。其中乙醇濃度對黃酮提取影響最為顯著。

根據相關文獻記載，與傳統的回流浸提法相比較，超聲波法提取法操作簡單、省時，提高了有效成分的提取率、原料的利用率。

［1］ 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志（第75卷）［M］.北京：科學出版社，1985：271.

［2］ 中國醫學科學院藥用植物資源開發研究所，等編著.中藥志（Ⅳ）（第二版）［M］.北京：人民衛生出版社，1988：368.

［3］ 李勝華.超聲波提取魚腥草葉總黃酮優化工藝研究［J］.食品科學，2006，27（12）：270-273.

［4］ 喬俊纏.線葉菊總黃酮含量測定［J］.中草藥，1998，29（7）：453-454.

R284.1