不同固定液對內皮細胞形態和EP4熒光染色的影響

韓陳陳，馬 旸，李亦凡，汪 揚，魏 偉

不同固定液對內皮細胞形態和EP4熒光染色的影響

韓陳陳，馬 旸，李亦凡，汪 揚，魏 偉

采用4種固定液對人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）進行固定：①-20℃無水甲醇溶液；②新鮮配制4 g/L多聚甲醛溶液；③久置（≥1個月）4 g/L多聚甲醛溶液；④3.7%甲醛溶液。觀察細胞形態和前列腺素受體4（EP4）免疫熒光染色效果。結果表明3.7%甲醛溶液固定后進行免疫熒光染色顯示大部分細胞維持梭形或不規則多邊形，EP4熒光染色效果較佳；所以3.7%甲醛溶液固定液固定細胞20 min，HUVECs形態典型，EP4的熒光染色效果最佳。

固定液；內皮細胞；EP4受體免疫熒光

血管內皮細胞是血液與血管壁之間的屏障，參與炎癥反應［1］，在類風濕關節炎發展過程中起著極為關鍵的作用，其分化遷移、增殖等作用增強會促進類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）滑膜血管新生，導致滑膜炎持續存在和血管翳生成［2］。前列腺素受體4（prostaglandin receptor 4，EP4）屬于G蛋白偶聯受體［3］，EP4脫敏在類風濕性關節炎等自身性免疫性疾病的發展中起著重要的作用［4-5］。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）作為介導炎癥反應的重要介質，參與調節血管內皮的生成［6-7］。但PGE2是否是通過EP4受體起作用及EP4受體表達與血管內皮細胞生成的關系仍不清楚。在EP4免疫熒光的實驗中發現，固定液對于實驗結果的影響至關重要。該研究通過選擇不同的固定液，以期找到既能保持細胞原有形態結構又不影響免疫熒光染色的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 山羊抗兔EP4抗體（英國Abcam公司）；兔源的熒光二抗（美國molecular probes公司）；胎牛血清（美國HyClone公司）；胰酶（南京Wisent公司）；DMEM（美國Gibco公司）；DAPI（上海Beyotime公司）；PBS緩沖液（北京中杉金橋生物技術有限公司）；無水甲醇溶液（天津星馬克科技發展有限公司）；多聚甲醛固體（國藥集團化學試劑有限公司）；甲醛溶液（37%～40%）（西隴化工股份有限公司）；TritonX-100（中國BIOSHARP公司）；BSA（上海Sigma公司）；IX-70熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；2306-2型CO2培養箱（美國SHEL LAB公司）。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVECs）培養 HUVECs（由安徽醫科大學臨床藥理研究所提供）以2×106個/ml密度接種于細胞培養瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM置于37℃、5%CO2孵箱中培養。

1.2.2 不同固定方法 待HUVECs達到80%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。用含10%小牛血清的DMEM培養液稀釋細胞至5×104個/ml，將細胞以500 μl/孔接種至48孔培養板中，待第2天細胞貼壁后，吸出培養液進行固定。不同固定方法：①-20℃預冷的無水甲醇溶液，室溫5 min；②新鮮配制的4 g/L多聚甲醛溶液，室溫20 min；③久置4 g/ L多聚甲醛溶液，室溫20 min；④3.7%甲醛溶液，室溫20 min。0.2%TritonX-100滲透作用15 min。

1.2.3 免疫熒光實驗 細胞在2%牛血清白蛋白（BSA）封閉液中封閉1 h后加入EP4抗體（稀釋比例1∶100），于4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育過夜。用PBS洗滌液洗滌3次后，再加入稀釋好的熒光標記的二抗溶液，4℃側擺搖床上繼續孵育1 h（避光）。PBS洗滌液洗滌3次后，加DAPI染色，5 min，PBS洗滌液洗滌1次；盡快在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

圖1 不同固定液對HUVECs形態的影響 SP×100

2 結果

2.1 不同固定液對HUVECs形態的影響 4種細胞固定方法中，從HUVECs形態上看，以-20℃預冷的甲醇和新鮮配制4%多聚甲醛對HUVECs形態影響較小。見圖1。鏡下觀察正常培養的HUVECs形態良好，多呈現梭形或不規則多邊形；-20℃無水甲醇溶液固定細胞，鏡下觀察HUVECs形態良好多呈現梭形或不規則多邊形；新鮮配置的4 g/L多聚甲醛固定液固定細胞，鏡下觀察HUVECs大部分呈梭形，部分細胞形態變圓；久置的4 g/L多聚甲醛溶液，鏡下觀察細胞形態大部分變圓、變小；3.7%甲醛溶液固定液，鏡下觀察大部分HUVECs維持梭形或不規則多邊形，只有少數細胞變小。

2.2 不同固定液對EP4免疫熒光染色效果的影響

從EP4免疫熒光染色結果看，3.7%甲醛溶液固定，熒光染色效果最好，EP4受體在胞質和胞膜表達，胞核無表達。見圖2。-20℃甲醇固定，熒光顯色模糊，EP4在胞質、胞膜、胞核均有表達；新鮮配置的4%多聚甲醛溶液固定，熒光染色效果較好，EP4大部分在胞質和胞膜表達，只有少數細胞胞核也有表達；久置的4%多聚甲醛溶液固定，DAPI染色后用熒光顯微鏡觀察只有胞核而無胞膜和胞質，未見EP4熒光染色，可能是實驗過程中固定液破壞了細胞膜導致的；3.7%甲醛溶液固定，EP4在胞質和胞膜表達，胞核無表達，熒光染色效果最好。

3 結論

免疫熒光細胞化學技術是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標志物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體），經過反應，形成的抗原抗體復合物帶有熒光素，在熒光顯微鏡下可分辨出抗原或抗體所在位置及性質［8］。免疫熒光方法中固定的目的是迅速終止酶的活性，避免組織細胞結構的解體，將抗原固定在原位，并保持其抗原性；同時使蛋白變性、凝固、沉淀，保持組織細胞原有的形態結構［9］，所以選擇最佳固定液尤為重要。對能在免疫熒光實驗中正常使用的固定液要求有3點［10］：①保持細胞或組織原有的形態；②保護抗原原有的定位及抗原特性；③細胞或組織經處理后具有良好的通透性，可使免疫化學試劑滲入。

圖2 不同固定液對EP4受體免疫熒光染色效果的影響 間接熒光染色×100

本研究結果表明，不同的固定液對HUVECs形態和EP4熒光染色有較大影響，3.7%甲醛溶液固定細胞20 min對保存HUVECs形態和抗原性效果最好。甲醛屬于交聯固定劑，可使細胞內蛋白之間相互交聯保存抗原于原位，因此能較好地保存抗原及組織細胞的形態結構。甲醇固定是通過蛋白變性作用實現的，更真實地反映出骨架蛋白在細胞的分布。甲醇固定劑是脂溶性的，會損傷細胞的通透性，用甲醇固定后，熒光染色很弱且核區不明顯，染色彌散，這可能與甲醇類固定劑對細胞核固定不良且會使蛋白降解有關。多聚甲醛是交聯固定劑，能夠使細胞內蛋白之間相互交聯保存抗原于原位，既能較好地保存組織細胞的形態結構，又能使蛋白質得以固定。但其缺點在于其交聯作用可能阻礙抗體的滲透，造成染色模糊［11］。同時，固定液放置一定時間可發生重聚作用，而且重聚作用的速度取決于pH值，pH值低時聚合加快，使固定效果下降［12］。因此，本研究根據抗原對固定劑的穩定性和細胞結構完整性的要求，在保持抗原性及細胞形態之間做某些選擇，使最大限度地減少固定劑對抗原性和細胞結構的破壞作用。

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Effect of different fixative on endothelial cells morphology and immunostaining of EP4 receptor

Han Chenchen，Ma Yang，Li Yifan，et al
（Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University，
Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune Medicine，Ministry of Education，
Anhui Collaborative Innovation Center of Anti-inflammatory and Immune Medicine，Hefei 230032）

Human umbilical endothelial cells（HUVECs）were fixed by four different fixative，①cells were fixed with precooled methanolsolution（-20℃）；②cells were fixed with fresh preparation of 4 g/L paraformaldehyde solution（PFA）；③cells were fixed with old 4 g/L PFA solution（more than a month）；④ cells were fixed with 3.7%formaldehydesolution.Cells which were fixed with 3.7%formaldehydesolution maintained fusiform or irregular polygon，and the prostaglandin recepter 4（EP4）immunostaining effect was the best.We concluded that 3.7% formaldehydesolution for 20 min was suitable for HUVECs immunofluorescence，HUVECs maintain typical cell morphology and the EP4 immunostaining effect was the best.

fixative；HUVECs cell morphology；EP4 immunofluoresce

R 9-331；R 361.2

A

1000-1492（2016）09-1372-03

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.064.html

2016-04-14接收

國家自然科學基金（編號：81502123、81330081）；安徽省自然科學基金（編號：1308085QH130）；安徽省高等學校省級自然科學研究項目（編號：KJ2014A119）

安徽醫科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點 實驗室，抗炎免疫藥物安徽協同創新中心，合肥 230032

韓陳陳，女，碩士研究生； 魏 偉，男，博士，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：wwei@ahmu.edu.cn； 馬 旸，女，博士，講師，責任作者，E-mail：mayang_ahmu@ 126.com