阿托伐他汀對(duì)高糖高脂下系膜細(xì)胞的影響

何笑云，歐春麟，肖艷華，周素嫻

阿托伐他汀對(duì)高糖高脂下系膜細(xì)胞的影響

何笑云1，歐春麟2，肖艷華1，周素嫻1

探討阿托伐他汀對(duì)高糖高脂環(huán)境下人腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的影響。將系膜細(xì)胞分為對(duì)照組、阿托伐他汀組、高糖高脂組、高糖高脂+阿托伐他汀組，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRTPCR）法檢測(cè)TGF-β1的表達(dá)以及用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IV型膠原（Col IV）和纖維連接蛋白（Fn）的含量。高糖高脂組較對(duì)照組TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05），而高糖高脂+阿托伐他汀組較高糖高脂組能明顯抑制TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平（P＜0.05）；高糖高脂組較對(duì)照組細(xì)胞上清液中ColⅣ、Fn含量明顯增加（P＜0.05），而這種作用可被阿托伐他汀所抑制（P＜0.05）。高糖高脂可增加系膜細(xì)胞分泌TGF-β1及ECM表達(dá)，而阿托伐他汀可逆轉(zhuǎn)這一作用。

阿托伐他汀；高糖高脂；系膜細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

1 材料與方法

1.1 材料 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（reverse transcription system）（貨號(hào)：A3500，美國(guó) Promega公司）；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（貨號(hào)：RR820A，日本TaKaRa公司）；D-葡萄糖（D-glucose，D-GS）（美國(guó)Biomol公司）、溶血卵磷脂（lysophosphatidylcholine，LPC）（美國(guó)Sigma公司）；阿托伐他汀（大連輝瑞制藥公司）；Ⅳ型膠原（collagenⅣ，ColⅣ）和纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)n）的ELISA試劑盒（深圳晶美生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 人腎小球系膜細(xì)胞為東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院饋贈(zèng)，所用培養(yǎng)液為含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞保持在37℃含有5%CO2的潮濕環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)過(guò)程共分為四組：①對(duì)照組（5.5 mmol/L D-GS）［6-7］；②阿托伐他汀組（10 μmol/L）；③高糖高脂組（30 mmol/L D-GS +20 mg/L LPC）；④ 高糖高脂+阿托伐他汀組（30 mmol/L D-GS+20 mg/L LPC+10 μmol/L阿托伐他汀）。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中ColⅣ和Fn的含量 收集細(xì)胞上清液，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組ColⅣ與Fn的含量，各組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法檢測(cè)TGF-β1 mRNA表達(dá)水平 采用TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行qRT-PCR法檢測(cè)。引物序列如下：人TGF-β1 mRNA的上游引物：5'-ACTACTACGCCAAGGAGGTCAC-3'，下游引物：5'-TGCTTGAACTTGTCATAGATTTCG-3'；人GAPDH mRNA的上游引物：5'-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3'，下游引物：5'-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3'，引物根據(jù)GenBank序列，用軟件 Primer Premier 5.0和Oligo 6.22設(shè)計(jì)，由華大基因生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。各組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以表示；采用單因素方差分析（One-way ANOVA）及兩兩比較的t檢驗(yàn)（Student t-test）分析。

表1 阿托伐他汀對(duì)高糖高脂下系膜細(xì)胞ColⅣ、Fn的影響（）

表1 阿托伐他汀對(duì)高糖高脂下系膜細(xì)胞ColⅣ、Fn的影響（）

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與高糖高脂組比較：#P＜0.05

項(xiàng)目 對(duì)照組 阿托伐他汀組 高糖高脂組 高糖高脂+阿托伐他汀組 F值 P值Col IV（μg/L） 4.54±0.74 3.75±0.79 16.32±1.55* 10.80±1.70# 64.75 0.00 Fn（mg/L） 3.90±0.43 3.09±0.67 7.89±0.34* 5.17±0.34# 60.50 0.00

2 結(jié)果

2.1 阿托伐他汀對(duì)高脂高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組（1.00±0.00）比較，高糖高脂組系膜細(xì)胞的TGF-β1 mRNA（1.88± 0.21）表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05），而高糖高脂+阿托伐他汀組（1.43±0.22）相對(duì)于高糖高脂組系膜細(xì)胞的TGF-β1 mRNA表達(dá)水平明顯受到抑制（F= 24.62，P＜0.05）。

2.2 高脂高糖環(huán)境對(duì)系膜細(xì)胞ECM分泌的影響收集實(shí)驗(yàn)各組的細(xì)胞上清液進(jìn)行ELISA法檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，高糖高脂組系膜細(xì)胞的細(xì)胞上清液中ColⅣ、Fn含量均升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 阿托伐他汀對(duì)高脂高糖環(huán)鏡下系膜細(xì)胞ColⅣ、Fn的影響 與高糖高脂組比較，高糖高脂+阿托伐他汀組的細(xì)胞上清液中ColⅣ、Fn含量明顯受到抑制（P＜0.05）。見(jiàn)表1。阿托伐他汀可抑制高糖高脂刺激引起的ECM相關(guān)因子的分泌。

3 討論

DN是DM的主要微血管并發(fā)癥之一，常常與DM患者終末期腎臟病密切相關(guān)。DN的發(fā)生發(fā)展與ECM積聚、系膜區(qū)的擴(kuò)張和基底膜的增厚等有關(guān)。ColⅣ和Fn作為ECM的重要成分，其過(guò)多沉積是誘發(fā)各種慢性腎臟疾病（如腎臟進(jìn)展性纖維化）的病理基礎(chǔ)。TGF-β1是目前被認(rèn)為最重要的促纖維化因子［8］，是TGF-β超家族的成員之一，通常以自分泌、旁分泌兩種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物功能。TGF-β1與DN的聯(lián)系密切，在DN腎臟肥大、腎小球和腎小管基底膜增厚及腎小管間質(zhì)纖維化［9］等中均扮演著重要角色。研究［10］顯示，高糖高脂飲食能夠促進(jìn)新西蘭兔表達(dá)ColⅣ、Fn和TGF-β1等分子，改變其腎小管、間質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)腎小管間質(zhì)的纖維化；本研究顯示，在高糖高脂環(huán)境下，系膜細(xì)胞TGF-β1 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組顯著增高，細(xì)胞上清液中ColⅣ、Fn含量也明顯增加。此外，Yang et al［11］研究發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素大鼠模型的腎皮質(zhì)TGF-β1表達(dá)升高，并且早于ECM擴(kuò)張；Hwang et al［12］也發(fā)現(xiàn)利用shRNA技術(shù)沉默TGF-β1的表達(dá)后，能夠顯著地下調(diào)Col-Ⅳ以及Fn的表達(dá)。可見(jiàn)，TGF-β1與DN發(fā)生過(guò)程中系膜細(xì)胞ECM的分泌密切相關(guān)。

阿托伐他汀是臨床一線的降脂藥物，耐受性極好，且不良反應(yīng)輕微。該藥通過(guò)抑制膽固醇與肝臟羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑合成，繼而降低血液內(nèi)的血清脂蛋白及膽固醇濃度。近年來(lái)的研究［13-14］顯示，阿托伐他汀在調(diào)節(jié)ECM的異常分泌中也扮演了重要角色，Schierwagen et al［13］研究發(fā)現(xiàn)在單關(guān)節(jié)扎的大鼠模型中，阿托伐他汀能夠明顯抑制ColⅠ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ的表達(dá)從而緩解大鼠的肝纖維化病情；本研究顯示，在阿托伐他汀的處理下，可明顯降低高糖高脂刺激人腎小球系膜細(xì)胞誘導(dǎo)的ColⅣ、Fn的分泌。此外，殷建等［14］對(duì)80例糖尿病腎病患者的腎功能相關(guān)血清指標(biāo)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀治療組血清中胱抑素C、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1、TGF-β1及ColⅣ等腎纖維化指標(biāo)的含量明顯降低；李成芳［15］對(duì)40例早期DN患者分組進(jìn)行阿托伐他汀治療，發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀能通過(guò)降低TGF-β1發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。本研究顯示，在阿托伐他汀的處理下，可明顯降低由高糖高脂刺激人腎小球系膜細(xì)胞誘導(dǎo)的TGF-β1表達(dá)升高。

綜上所述，糖尿病高糖合并脂代謝紊亂的情況下，可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)以及ECM相關(guān)因子（ColⅣ、Fn）的分泌，大大增加了腎小球纖維化的可能性；而阿托伐他汀可明顯抑制高糖高脂的這種作用，為DN的治療提供新的策略。

［1］ Mora-Fernandez C，Dominguez-PimentelⅤ，de Fuentes M M，et al.Diabetic kidney disease：from physiology to therapeutics［J］.J Physiol，2014，592（18）：3997-4012.

［2］ 李成芳.阿托伐他汀對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的影響［J］.臨床肺科雜志，2015，20（3）：506-8.

［3］ Gao P，Li L，Ji L，et al.Nrf2 ameliorates diabetic nephropathy progression by transcriptional repression of TGFbeta1 through inter-actions with c-Jun and SP1［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1839（11）：1110-20.

［4］ Wang T，Chen S S，Chen R，et al.Reduced beta 2 glycoprotein I improves diabetic nephropathy via inhibiting TGF-beta1-p38 MAPK pathway［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（3）：2321-33.

［5］ Hathaway C K，Gasim A M，Grant R，et al.Low TGFβ1 expression prevents and high expression exacerbates diabetic nephropathy in mice［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112（18）：5815-20.

［6］ 周素嫻，雷閩湘，趙晉晉，等.高糖高脂對(duì)系膜細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)及PAF的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2009，25（10）：2056-7.

［7］ 周素嫻，雷閩湘，趙晉晉.D-葡萄糖對(duì)系膜細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的時(shí)效與量效研究［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2009：31（08）：1072-3.

［8］ Munoz-Felix J M，Oujo B，Lopez-Novoa J M.The role of endoglin in kidney fibrosis［J］.Expert Rev Mol Med，2014，16：e18.

［9］ Huang W，Xu C，Kahng K W，et al.Aldosterone and TGF-beta1 synergistically increase PAI-1 and decrease matrix degradation in rat renal mesangial and fibroblast cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2008，294（6）：F1287-95.

［10］李宏光，蔡元菊，鄒錦慧，等.高糖高脂飲食對(duì)兔腎小管間質(zhì)纖維化的影響［J］.動(dòng)物學(xué)雜志，2010，45（1）：145-50.

［11］Yang Y，Zhang S Y，Sich M，et al.Glomerular extracellular matrix and growth factors in diffuse mesangial sclerosis［J］.Pediatr Nephrol，2001，16（5）：429-38.

［12］Hwang M，Kim H J，Noh H J，et al.TGF-beta1 siRNA suppresses the tubulointerstitial fibrosis in the kidney of ureteral obstruction ［J］.Exp Mol Pathol，2006，81（1）：48-54.

［13］Schierwagen R，Leeming D J，Klein S，et al.Serum markers of the extracellular matrix remodeling reflect antifibrotic therapy in bile-duct ligated rats［J］.Front Physiol，2013，4：195.

［14］殷 建，歐 妍.阿托伐他汀對(duì)糖尿病腎病患者腎功能相關(guān)血清指標(biāo)及腎臟纖維化的影響觀察［J］.河北醫(yī)學(xué)，2015，21（1）：49-52.

［15］李成芳.不同劑量阿托伐他汀對(duì)早期糖尿病腎病TGF-β1的影響［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，10（27）：198-9.

Effect of Atorvastatin on the mesangial cells exposed to high glucose and lysophosphatidylcholine

He Xiaoyun1，Ou Chunlin2，Xiao Yanhua1，et al
（1Dept of Endocrinology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001；
2Cancer Research Institute，Central South University，Changsha 410078）

To investigate the effect of Atorvastatin on the role of extracellular matrix（ECM）and transforming growth factor-β1（TGF-β1）of masangial cells in high glucose and lysophosphatidylcholine（LPC）environment. First，the expression of TGF-β1 was detected by qRT-PCR，then divided the human mesangial cells into four groups：control，Atorvastatin，high glucose and LPC，high glucose and LPC with Atorvastatin.All the groups were cultured for 24 h.Meanwhile，the levels of collagen IV and fibronectin in the supernatant were detected by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.Compared with the control group，the expression of TGF-β1 mRNA in high glucose and LPC group was significantly increased（P＜0.05）.However，the expression of TGF-β1 mRNA in high glucose and LPC with Atorvastatin group were significantly decreased compared to high glucose and LPC group（P＜0.05）；Compared with the control group，the level of collagenⅣand fibronectin in the supernatant of high glucose and LPC group was increased significantly（P＜0.05）.However，the effect could be inhibited by Atorvastatin（P＜0.05）.High glucose and LPC can promote the secretion of ECM and the expression of TGF-β1 in mesangial cells，however，the effect can be inhibited by Atorvastatin obviously.

Atorvastatin；high glucose and lysophosphatidylcholine；mesangial cells；transforming growth factorβ1

R 692.6

A

1000-1492（2016）09-1375-03

時(shí)間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.066.html糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是一種在糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者臨床發(fā)病率占20%～40%的代謝紊亂性疾病，常具有進(jìn)行性腎間質(zhì)纖維化的特征［1］。阿托伐他汀是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，在降脂、改善內(nèi)皮功能、抑制細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）聚集等方面發(fā)揮著重要角色［2］。盡管轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）與DN的發(fā)生密切相關(guān)［3-5］，但在DN發(fā)生過(guò)程中，阿托伐他汀與TGF-β1的關(guān)系尚未明確。該研究通過(guò)探討阿托伐他汀對(duì)高糖高脂條件下TGF-β1及ECM的影響，以進(jìn)一步揭示DN的發(fā)病機(jī)制。

2016-04-19接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81260314、81560148）；廣西碩士研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：YCSZ2015218）

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，桂林 5410012中南大學(xué)腫瘤研究所，長(zhǎng)沙 410078

何笑云，女，碩士研究生；周素嫻，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zoe_ doctor@163.com