Lowry法測定重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的方法驗證

黎 勇，尹海燕（山西康寶生物制品股份有限公司，山西長治 046000）

Lowry法測定重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的方法驗證

黎 勇，尹海燕
（山西康寶生物制品股份有限公司，山西長治 046000）

試驗驗證了Lowry法測定重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的方法，為后續試驗提供重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的檢測方法。以蛋白含量測定國家標準品為標準品，在100～0 μg/mL濃度范圍內建立標準曲線，線性關系良好，相關系數（R2）大于0.99。標準曲線上至少6點（包含兩端）滿足準確度介于95.2%～111.67%，標準曲線下限準確度介于95.98%～103.6%。高、中、低質量濃度（80，40，20 μg/mL）質控樣本批內精密度均介于1.51%～4.41%，批間精密度均介于3.83%～6.36%。綜合上述信息，Lowry法測定重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的方法穩定，可重現。重組人血清白蛋白-白細胞介素2在200～10 μg/mL質量濃度范圍內均一。

lowry法；蛋白濃度；方法學驗證

本試驗驗證了Lowry法測定重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的方法，為后續試驗提供重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的檢測方法。現將試驗結果總結如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

標準品，中國食品藥品檢定研究院購買，批號為270009-201106；供試品，重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白，批號為20140512，規格為0.2 mg/瓶。SIGMA-ALDRICH酚試劑；廣東西隴化工廠硫酸銅；國藥集團化學試劑有限公司碳酸鈉、酒石酸鉀；西隴化工股份有限公司氫氧化鈉。

1.2 標準樣本

取蛋白含量測定國家標準品一支，用水定量稀釋至每1 mL含1 mg，作為儲備液，即為每1 mL含1 000 μg的標準蛋白質溶液。用純化水將1 mg/mL的標準品儲備液分別稀釋至100，80，60，40，20，10 μg/mL作為標準曲線的Cal 1～Cal 6，以純化水作為Blank（空白對照孔）。

質控樣本及最低定量限樣本：用純化水將供試品分別稀釋至80，40，20，10 μg/mL作為高、中、低質量濃度質控樣本及最低定量限樣本。

均一性樣本：將供試品用純化水分別稀釋至200，50，10 μg/mL作為高、中、低質量濃度均一性樣本。

加標回收率樣本：將供試品用純化水稀釋至20，40，60 μg/mL作為未加標樣本；將供試品用純化水稀釋至20，40，60 μg/mL，并分別加入20 μg/mL的蛋白含量測定國家標準品作為加標樣本。

1.3 試驗方法

精密量取一定體積的供試品置試管內，加純化水至1 mL，加堿式碳酸銅溶液5 mL，搖勻，室溫放置10 min，快速加入酚試劑0.5 mL，搖勻，室溫放置30 min，顯色后，照紫外可見分光光度法，于波長650 nm處測定吸光度。精密量取標準蛋白質溶液0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mL分別置于試管中，自“加水至1 mL”起，同法操作。準確量取水1 mL，自“加堿式碳酸銅溶液5 mL”起，同法操作，作為空白對照。以標準曲線的蛋白質濃度對應其吸光度，求直線回歸方程；將測得供試品的吸光度代入直線回歸方程，即得供試品的蛋白質含量。

2 方法驗證方法

2.1 標準曲線

在100～0 μg/mL范圍內繪制標準曲線，要求相關系數（R2）大于0.99。標準曲線上至少6點（包含兩端）滿足準確度（實測值/理論值×100%）介于85%～115%，標準曲線下限附近準確度介于80%～120%。

2.2 精密度與準確度［1］

一條標準曲線、3個質量濃度質控樣本（每個質量濃度6個樣本）為一個分析批，測定3個分析批，每個質量濃度質控樣本至少5個滿足以下要求。

批內精密度：要求質控樣本CV不大于10%，在定量下限附近樣本的CV不大于15%。批間精密度：進行3批次試驗，要求每批次質控樣本CV不大于10%，低濃度質控樣本的CV不大于15%。

質控樣本的準確度介于85%～115%，低質量濃度質控樣本準確度介于80%～120%。

2.3 定量下限［2］

以標準曲線最低質量濃度作為分析方法的定量下限?？疾?個樣本，要求至少5個樣本CV不大于15%，準確度介于80%～120%。

2.4 均一性樣本

取高、中、低質量濃度均一性樣本測定（高質量濃度均一性樣本用純化水稀釋至50 μg/mL后測定，中、低質量濃度均一性樣本直接測定），各考察6個樣本。測定結果的準確度介于85%～115%（低質量濃度樣本準確度介于80%～120%），測定結果的CV在15%以內視為樣本均一。

2.5 加標回收率樣本

取加標回收率樣本測定，未加標樣本和加標樣本各考察3個樣本，樣本測定結果的準確度介于85%～115%視為滿足要求，加標回收率介于80%～120%視為滿足要求［3-4］。

3 試驗結果

3.1 標準曲線

在100～0 μg/mL范圍內，以質量濃度為縱坐標（Y）、吸光度為橫坐標（X）線性擬合繪制標準曲線，相關系數（R2） 大于0.99。標準曲線上至少6點（包含兩端）滿足準確度介于95.2%～111.67%，標準曲線下限準確度介于95.98%～103.6%。

標準曲線及準確度的測定見表1。

表1 標準曲線及準確度的測定/μg·mL-1

3.2 精密度與準確度

一條標準曲線、3個質量濃度質控樣本（每個質量濃度6個樣本）為一個分析批，測定3個分析批，每個質量濃度質控樣本滿足以下要求。

精密度：高、中、低質量濃度（80，40，20μg/mL）質控樣本批內精密度均介于1.51%～4.41%，批間精密度均介于3.83%～6.36%。

準確度：各質量濃度質控樣本的準確度均介于91.6%～114.38%。

精密度試驗結果見表2。

3.3 定量下限

以標準曲線最低質量濃度作為分析方法的定量下限，6個樣本CV為5.49%，準確度介于95.98%～108.3%。

定量下限試驗結果見表3。

3.4 均一性樣本

重組人血清白蛋白-白細胞介素2各濃度均一性樣本的準確度介于86.28%～113.97%，CV介于2.27%～10.16%。

均一性樣本試驗結果見表4。

3.5 加標回收率樣本

未加標樣本的準確度介于89.23%～102.05%，加標回收率介于84.73%～107.21%。

回收率試驗結果見表5。

表2 精密度試驗結果

表3 定量下限試驗結果

表4 均一性樣本試驗結果

3.6 影響研究可靠性和造成研究工作偏離試驗方案的異常情況

標準品保存條件為-20℃或以下溫度，實際保存溫度為-14.8～-33.9℃，超出規定溫度最長持續時間小于1.5 h。鑒于溫度偏差不大，持續時間不長，且后續檢測中標準曲線穩定，故認為該偏離對試驗結果無影響。

未見其他影響研究可靠性和造成研究工作偏離試驗方案的異常情況。

4 結論

Lowry法測定重組人血清白蛋白-白細胞介素2融合蛋白含量的方法穩定，可重現。重組人血清白蛋白-白細胞介素2在200～10 μg/mL質量濃度范圍內均一。

The study on Methodology Validation of Recombinant Human Serum Albumin Interleukin 2 Fusion Protein by Lowry Method

LI Yong，YIN Haiyan
（Shanxi Kangbao Biological Products Co.，Ltd.，Changzhi，Shanxi 046000，China）

This test verifies the Lowry method which determines the content of recombinant fusion protein human serum albumin-interleukin 2，and provides a method that can determine the content of recombinant fusion protein human serum albumin-interleukin 2 for the following experiment.Methods:In the experiment of determination of protein content，national standard protein was measured as the standard，in the concentration range of 100～0 μg/mL we create a standard curve with good linear correlation and the coefficient（R2） is greater than 0.99.Results:The standard curve contains six points（both ends inclusive） at least and it can satisfy the accuracy ranged from 95.2%～111.67%，and the accuracy of the lower limit of the standard curve is between 95.98%～103.6%.The precisions of protein concentration（high，middle，low）of samples were between 1.51%～4.41%.The precisions between three batches were 3.83%～6.36%.The Lowry method for protein concentration of human serum albumin-interleukin 2 fusion is stable and repeatable.The data of protein concentration between 200～10 μg/mL were stable.

lowry method；protein concentration；method validation

R927.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.10.013

1671-9646（2016）10a-0042-03

2016-07-15

黎 勇（1982— ），男，本科，助理工程師，研究方向為生物制藥的發酵、純化、檢驗及檢驗的方法學驗證。