荔枝果肉不同酚類成分群的分離及其抗氧化活性

董麗紅，張瑞芬，肖 娟，鄧媛元，張 雁，劉 磊，黃 菲，魏振承，張名位

（1廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所/農業部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室，廣州 510610；2華中農業大學食品科學技術學院，武漢 430070）

荔枝果肉不同酚類成分群的分離及其抗氧化活性

董麗紅1，2，張瑞芬1，肖 娟1，鄧媛元1，張 雁1，劉 磊1，黃 菲1，魏振承1，張名位1

（1廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所/農業部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室，廣州 510610；2華中農業大學食品科學技術學院，武漢 430070）

【目的】比較荔枝果肉不同酚類成分群的總酚、總黃酮和縮合單寧含量、單體酚組成及抗氧化活性差異，明確荔枝果肉中發揮抗氧化作用的有效酚類成分，為揭示荔枝果肉發揮健康效應的物質基礎提供依據。【方法】利用C18硅膠層析柱將荔枝果肉多酚提取物分離成F1、F2、F3和F4共4個不同的酚類成分群，分析各成分群的總酚、總黃酮和縮合單寧含量及單體酚組成，采用鐵離子還原能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP）、1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）自由基消除能力、氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）及細胞抗氧化能力（cellular antioxidant ability，CAA）4種抗氧化活性評價體系比較這4個成分群的抗氧化活性大小。【結果】荔枝果肉多酚提取物可以分為F1、F2、F3和F4共4個酚類成分群，其中F2的得率高達36%，其他成分群得率分別為18.71%、16.79%、21.12%；各酚類成分群的總酚、總黃酮和縮合單寧含量分別介于218.86—499.78 mg GAE·g-1DW、414.94—1 285.45 mg RE·g-1DW、83.35—483.43 mg CE·g-1DW。4個成分群中F2的總酚、總黃酮和縮合單寧含量最高，對荔枝果肉多酚提取物相應的貢獻率最大，分別為50.31%、54.24%、72.06%，均高于其余3個成分群的貢獻率；其次是F3和F4；F1的最低。經HPLC分析和鑒定發現F2成分群主要為原花青素B2、表兒茶素等單體酚，F3僅含槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷一種單體酚，F4中含有蘆丁等。抗氧化活性評價結果顯示，4個成分群的FRAP抗氧化能力大小順序為F2＞F3＞F4＞F1；DPPH消除能力的IC50值分別為27.00、9.76、19.41和16.25 μg·mL-1，其中F2的IC50值最小，即DPPH消除能力最強，其次是F4、F3，F1最弱；ORAC抗氧化能力順序為F2＞F3＞F4＞F1，CAA抗氧化能力順序為F2＞F3＞F4、F1，其中F2的ORAC和CAA抗氧化能力分別為8.36 mmol TE·g-1DW和190.71 μmol QE·g-1DW，對荔枝果肉多酚提取物ORAC和CAA值的貢獻率分別高達50.42%和84.91%。【結論】荔枝果肉4個酚類成分群間的總酚、總黃酮和縮合單寧含量及抗氧化活性均存在顯著差異，各成分群的單體酚組成亦各有特點，其中F2成分群的得率及總酚、總黃酮和縮合單寧含量最高，抗氧化活性最好，是荔枝果肉抗氧化作用的最主要酚類物質。

荔枝果肉；多酚；分離；成分群；抗氧化作用

0 引言

【研究意義】荔枝（Litchi chinensis Sonn.）為無患子科常綠果樹，是華南地區的主要特色水果，果肉營養豐富，享有“中華之珍品、嶺南果王”的美譽［1］。盡管中國荔枝在產量和品質方面都具有顯著優勢，但受保鮮和加工技術的限制，產業鏈的延展和產業規模的增長困難重重，因此，開展精深加工與利用研究、延長其產業鏈是促進荔枝產業可持續發展的必由之路。中醫認為荔枝果肉具有健脾、益肝、養顏功效，現代研究報道荔枝果肉具有抗氧化、抗輻射和護肝等生物活性［2-4］。多酚是一大類重要的非營養素植物活性物質，對于維持人體健康、降低多種慢性疾病的發病風險有重要作用［5］。研究已證實荔枝果肉富含多酚等活性物質［6］，前期研究表明荔枝果肉多酚具有明顯的抗氧化活性，但采用的是多種酚類物質的混合提取物，其酚類組成頗為復雜，有效的酚類成分尚不明確。探明荔枝果肉中發揮抗氧化作用的有效酚類成分可以為準確揭示荔枝果肉發揮健康效應的物質基礎提供依據，對指導荔枝精深加工與利用具有重要的科學意義和經濟價值，也為進一步挖掘對人體健康有保護作用的膳食因子，開發功能性食品提供依據。【前人研究進展】目前，國內外對荔枝果皮和果核中酚類物質及抗氧化活性研究已有不少報道，DUAN等［7］和SUN等［8］研究表明荔枝果皮花青素、表兒茶素和原花青素二聚體具有良好消除1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）自由基，羥基自由基及超氧陰離子自由基的能力；LIU等［9］發現果皮中A型原花青素二聚體和三聚體的抗氧化能力較表兒茶素高，可能與其分子結構中羥基數量有關；ZHOU等［10］發現荔枝果核中高聚原花青素具有鐵離子還原能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP）和DPPH等抗氧化活性，且較果皮高聚原花青素的活性好。然而，對荔枝可食用部分果肉中酚類物質及其生物活性研究較少。SU等［11］研究發現荔枝果肉多酚提取物具有良好的氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）和細胞抗氧化能力（cellular antioxidant ability，CAA），經HPLC初步鑒定該提取物含有兒茶素、香草酸、咖啡酸、表兒茶素、4-甲基兒茶酚、蘆丁等多種酚類化合物。隨后，SU等［12］從荔枝果肉中分離純化并采用電噴霧電離質譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）等手段鑒定出表兒茶素、蘆丁和槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷3種單體酚，比較其ORAC、CAA抗氧化能力的差異，發現第三種單體酚的活性最好，但并不能完全證明其為最有效的成分。【本研究切入點】近來的研究認為植物活性物質發揮藥理活性的往往不是某種單一的化學成分而是一組成分群共同作用的結果［13］。荔枝果肉富含的酚類物質種類繁多，若將荔枝果肉分成不同的酚類成分群，以此來確定其發揮抗氧化作用的有效成分群，這不僅考慮了某些含量較低或單獨作用活性較弱的成分對主要活性成分可能具有的協同增效作用，確定出更接近提取物作用效果的有效酚類成分群，而且可以提高工作效率。【擬解決的關鍵問題】基于以上問題，本研究首先結合高效液相色譜法的原理，采用C18硅膠層析柱分離、純化得到荔枝果肉的不同酚類成分群，然后采用DPPH、FRAP、ORAC、CAA等多種抗氧化的評價方法來評價比較荔枝果肉不同酚類成分群的抗氧化活性差異，旨在明確荔枝果肉發揮抗氧化作用的主要酚類成分群，為植物活性成分的篩選提供新思路。

1 材料與方法

試驗于2014年7月至2015年10月在廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所/農業部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室內進行。

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料 荔枝品種為‘懷枝’（Litchi chinensis Sonn. cv. Huaizhi），2014年7月采自廣東省農業科學院果樹研究所種質資源圃。沒食子酸（gallic acid）、表兒茶素（epicatechin）、原花青素B2（procyanidin B2）、蘆丁（rutin）、槲皮素（quercetin）、DPPH、ABAP（2，2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽）、Trolox（水溶性維E）、DCFH-DA（2′，7′-二氯熒光黃二乙酸鹽）、熒光素二鈉鹽和福林酚試劑均購自Sigma公司；MEM細胞培養基、胎牛血清、HPLC級甲醇、乙酸和乙腈購自Thermo Fisher Scientific公司；FRAP測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；HepG2人肝癌細胞由中國科學院干細胞庫提供；其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 主要儀器 EYELAN-1100旋轉蒸發儀，東京理化器械株式會社；FDU-2110真空冷凍干燥機，東京理化器械株式會社；LC-1260型高效液相色譜儀，Agilent公司；UV-1800型紫外可見分光光度計，日本島津有限公司；Infinite M200pro酶標儀，Tecan公司；HeraCell 240i CO2培養箱，Thermo Fisher Scientific公司；DMI3000B型倒置熒光顯微鏡，Leica公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 荔枝果肉不同酚類成分群的分離制備 荔枝果肉不同酚類成分群的分離制備工藝流程見圖1，具體步驟如下所示。

圖1 荔枝果肉不同酚類成分群的分離制備流程圖Fig. 1 The preparation of different phenolic compound fractions from litchi pulp

1.2.1.1 荔枝果肉多酚的制備 新鮮荔枝去皮去核后，將果肉浸泡在70%的乙醇溶液中（料液比1∶3，w/v），轉入冰水浴內切式勻漿機均質5 min，離心后收集上清液，置于旋轉蒸發儀內45℃減壓回收乙醇，殘留的水溶液為荔枝果肉多酚粗提液。將粗提液經過AB-8大孔樹脂吸附后，蒸餾水洗脫以除去可溶性糖和其他小分子化合物，再用70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，于45℃減壓濃縮，得到深黃色濃縮液，真空冷凍干燥后即為荔枝果肉多酚提取物（以下簡稱LPP）。

1.2.1.2 C18硅膠柱分離得到荔枝果肉不同酚類成分群 稱取一定量LPP，溶于蒸餾水中（加入少量DMSO助溶），上樣于C18硅膠層析柱（15 cm×6.0 cm，40 μm），給予適當的泵壓力將流速調整為4 mL·min-1，待樣品吸附完成后，依次采用不同濃度的乙腈/水（v/v）和甲醇/水（v/v）進行梯度洗脫，洗脫流速為6 mL·min-1，每6 min收集一流分，并用HPLC檢測分析，合并圖譜組成相近的流分，再分別經改良的聚苯乙烯填充層析柱（15 cm×6.0 cm，60 μm，以下簡稱PIPO-2柱）吸附脫水，再用甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，冷凍干燥，最終得到4個組成不同的荔枝果肉酚類成分群，以下簡稱為F1、F2、F3和F4。LPP及4個成分群的HPLC譜見圖2，根據LPP及各成分群的吸收峰出峰時間對比，可見4個成分群的分離效果較好。

1.2.2 荔枝果肉各酚類成分群的單體酚組成及含量HPLC分析 稱取適量的各待測樣品溶解在甲醇中配制成濃度為2 mg·mL-1的溶液，經0.22 μm濾膜過濾后采用安捷倫1260型HPLC-DAD測定，參照ZHANG等［14］建立的方法。流動相：流動相A為0.4%（v/v）的冰乙酸，流動相B為乙腈，洗脫梯度為0—40 min B 5%—25%，40-—45 min B 25%—35%，45—50 min B 35%—50%，后運行平衡時間5 min；色譜柱為 Zorbax SB-C18反相色譜柱（4.6 mm×100 mm，5 μm，Agilent公司）；柱溫為30℃；流速為1.0 mL·min-1；進樣體積為20 μL；檢測波長為全波長掃描，以280 nm為主要觀察波長。樣品色譜峰與標準品吸收峰保留時間及全波長掃描圖對比定性，峰面積外標法定量。

1.2.3 荔枝果肉各酚類成分群的酚類含量測定

1.2.3.1 總酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteu法［15］：以沒食子酸溶液為標準品，標準曲線為Y=0.0021X+0.0329，R2=0.9949，其中：X為沒食子酸濃度（μg·mL-1），Y為吸光度，檢測波長為765 nm。樣品中的總酚含量以每g干基中所含沒食子酸當量（GAE）表示，單位為mg GAE·g-1DW。

1.2.3.2 總黃酮含量的測定 采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法［15］：以蘆丁為標準品，標準曲線為Y=11.6120X+0.0086，R2=0.9996，其中：X為蘆丁濃度（mg·mL-1），Y為吸光度，檢測波長為 510 nm。樣品中的總黃酮含量以每g干基中所含蘆丁當量（RE）表示，單位為mg RE·g-1DW。

1.2.3.3 縮合單寧含量的測定 采用香草醛-硫酸法［16］：以兒茶素作為對照，標準曲線為Y=2.0669X-0.0196，R2=0.9993，其中：X為兒茶素濃度（mg·mL-1），Y為吸光度，檢測波長為 500 nm。樣品中的縮合單寧含量以每g干基中所含兒茶素當量（CE）表示，單位為mg CE·g-1DW。

1.2.4 FRAP抗氧化能力測定 參照XU等［17］的方法，按照試劑盒說明測定。配制適量的FRAP工作液，現配現用，配好后37℃孵育待用。96孔板的每個檢測孔中加入180 μL FRAP工作液，然后空白檢測孔中加入5 μL蒸餾水，標準檢測孔內分別加入5 μL各種濃度的FeSO4標準溶液，樣品檢測孔內加入5 μL待測樣品。輕輕混勻，37℃孵育5 min后，采用酶標儀測定A593。根據標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力（FRAP值），以達到相同吸光度值所需的Fe2+摩爾濃度表示。

1.2.5 DPPH自由基清除率的測定 參照EBRAHIMZADEH等［18］的方法作適當改良。稱取4.00 mg DPPH溶解于100 mL無水乙醇中，為DPPH工作液，現配現用。取100 μL不同濃度的各樣品溶液，加入900 μL的DPPH工作液，室溫避光靜置30 min，于517 nm處測定吸光度Ai，同時測定900 μL的DPPH工作液與100 μL無水乙醇溶液的吸光度A1以及900 μL無水乙醇與100 μL樣品溶液的吸光度A0。每個樣品每個濃度重復3次，取平均值，計算DPPH自由基清除率，同時求得清除率為50%時所需樣品濃度，即IC50值。

式中，Ai：樣品與DPPH工作液反應后的吸光值；A0：樣品與無水乙醇反應后的吸光值；A1：無水乙醇與DPPH工作液反應后的吸光值。

1.2.6 ORAC抗氧化能力測定 ORAC的測定采用熒光酶標儀檢測法。Trolox標準品及各種待測樣品用75 mmol·L-1磷酸緩沖液（pH=7.4）溶解稀釋到適當的濃度，反應用黑色96孔板，首先空白孔中加入20 μL磷酸緩沖液，其余孔中分別加入不同濃度的Trolox標準溶液（6.25、12.5、25、50 μmol·L-1）、樣品溶液以及17.5 μmol·L-1的沒食子酸溶液，將96孔板放入熒光酶標儀中37℃孵育10 min；然后每孔加入200 μL 0.96 μmol·L-1熒光素鈉溶液，37℃孵育20 min；之后除F孔外，每孔加入20 μL ABAP溶液（119 mmol·L-1，臨用前用緩沖液配制），熒光酶標儀測定每孔的熒光值，測定條件如下：激發波長485 nm，發射波長520 nm，35個循環，每個循環4.5 min。根據Trolox標準曲線計算樣品的ORAC值，單位為mmol TE·g-1DW。

1.2.7 細胞抗氧化能力測定 細胞抗氧化能力（CAA）測定參考WOLFE等［19］的方法。測定原理是細胞經待測樣品和本身無熒光的指示劑DCFH-DA混合物預處理，樣品中的抗氧化物質結合在細胞膜上或進入細胞內，而DCFH-DA被細胞酯酶分解形成極性更強的還原性二氯熒光素DCFH，然后用ABAP處理細胞，ABAP分散在細胞中并自發分解形成過氧化自由基（ROO+），將DCFH氧化成有熒光的DCF。若存在抗氧化物質，則可消除ROO+，DCF的生成量減少，即熒光強度減弱。具體步驟如下：將處于對數生長期的HepG2細胞懸液種到黑壁透明底96孔細胞培養板中，每孔100 μL，細胞密度約為5×104/孔。板的最外周一圈不種細胞，只加入100 μL PBS。細胞生長24 h后，吸除培養基，用PBS 100 μL/孔清洗各孔一次。然后將100 μL不同濃度的槲皮素溶液或待測樣品溶液（用MEM培養基溶解稀釋，且含有25 μmol·L-1DCFH-DA 的熒光素檢測液）加入到相應孔中，空白對照孔中加入只含有25 μmol·L-1DCFH-DA 的熒光素檢測液，放入培養箱中繼續培養1 h。然后去除各孔中的處理溶液，用多通道移液器迅速向各孔中加入100 μL ABAP溶液（600 μmol·L-1，臨用前用PBS配制），空白孔中用PBS代替。迅速將細胞培養板放入熒光酶標儀中開始檢測，測定條件為：激發波長485 nm，發射波長520 nm，12個循環，每個循環5 min。繪制工作曲線計算槲皮素和樣品的EC50值，以槲皮素EC50與樣品EC50的比值為樣品的CAA值，單位為μmol QE·g-1DW。

1.3 數據統計與分析

用SPSS 18.0和Origin 8.0軟件進行數據統計分析及作圖，圖表中所有數據均以Mean±SD表示，荔枝果肉不同酚類成分群的多酚含量及抗氧化能力比較采用單因素方差分析，Tukey檢驗。統計結果P＜0.05認為差異達顯著性水平。

2 結果

2.1 荔枝果肉各酚類成分群的得率及總酚、總黃酮和縮合單寧含量

由表1可知，F2成分群的得率最高，達到36.10%，其余3個成分群的得率分別為18.71%、16.79%、21.12%。各成分群的總酚、總黃酮和縮合單寧含量分別介于218.86—499.78 mg GAE·g-1DW、414.94—1 285.45 mg RE·g-1DW、83.35—483.43 mg CE·g-1DW。其中，F2成分群的總酚含量最高，其次是F3、F4，F1最低（P＜0.05），且F2對荔枝果肉總多酚含量的貢獻率高達50.31%，高于F1、F3和F4這3個成分群的貢獻率之和（46.92%），F1的貢獻率最低，僅為11.42%，而由于F3在荔枝果肉中占比較少，則其貢獻率略低于F4。4個成分群的總黃酮含量及其貢獻率的結果與總酚的結果類似。F2的縮合單寧含量顯著高于其余3個成分群（P＜0.05），對荔枝果肉多酚總含量的貢獻率高達72.06%，是F1、F3、F4三者貢獻率之和（27.20%）的2.67倍，提示荔枝果肉中部分多酚屬于原花青素類，且這些原花青素類化合物主要富集在F2中。因此，F2成分群的得率及總酚、總黃酮和縮合單寧含量均最高。

表1 荔枝果肉不同酚類成分群的得率及酚類含量Table1 Yield， total phenol， flavonoid and tannin content of different phenolic compound fractions from litchi pulp

2.2 荔枝果肉各酚類成分群的單體酚組成及含量

由圖2可知，F1成分群含有5種主要化合物，對應峰號為1—5；F2亦含有5種主要化合物，對應峰號為6—10；F3僅含一種化合物，峰號為11；F4含有4種主要化合物，對應峰號為12—15。HPLC-DAD分析荔枝果肉各酚類成分群的單體酚組成及含量（表2）。結果表明，F1的5種化合物未鑒定出是何種物質，則根據峰面積以沒食子酸當量（mg GAE·g-1DW）分別計算其相對含量，峰3含量最高，峰2次之，其余3個物質含量相近；F2中峰6鑒定為原花青素B2，峰9為表兒茶素，其含量分別為（113.87±3.86）mg·g-1DW和（19.03±1.35）mg·g-1DW，前者含量是后者的5.98倍，而其余3個未知化合物的相對含量通過峰面積以表兒茶素當量（mg EE·g-1DW）分別計算，其中峰6（原花青素B2）和峰10含量遠高于其他成分，是F2中最主要的兩種物質；F3為槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷單體酚，純度達到90%以上；F4中峰14鑒定為蘆丁，含量較低，僅為（32.36±0.45） mg·g-1DW，其余3個未知化合物則根據峰面積以蘆丁當量（mg RE·g-1DW）分別計算其相對含量，其中峰15的含量最高，是蘆丁的3.66倍。可見，各酚類成分群的單體酚組成各有特點。

2.3 荔枝果肉各酚類成分群的FRAP抗氧化能力

由圖3可知，在試驗測定濃度范圍內，荔枝果肉4個酚類成分群均具有一定的抗氧化能力。FRAP值越大，抗氧化物質的抗氧化活性越強。隨濃度的升高，各樣品的抗氧化能力均增強。但是，在同等濃度下，荔枝果肉不同酚類成分群之間的FRAP抗氧化能力有所差異，F2和F3成分群的抗氧化能力顯著大于F1和F4（P＜0.05）。其中，在低濃度范圍內，F2與F3的抗氧化能力差異不大，但當濃度≥0.4 mg·mL-1時，F2的抗氧化能力顯著高于F3（P＜0.05）；隨著濃度的逐漸增加，F4的抗氧化能力亦顯著高于F1（P＜0.05）。因此，整體來看，荔枝果肉4個酚類成分群的FRAP抗氧化能力大小為：F2＞F3＞F4＞F1。

表2 荔枝果肉各酚類成分群的單體酚組成及含量Table2 Composition and content of free phenol in different phenolic compound fractions from litchi pulp

圖2 C18硅膠柱分離荔枝果肉不同酚類成分群的HPLC譜Fig. 2 HPLC spectrum of different phenolic compound fractions from litchi pulp by C18 silica gel column

圖3 不同質量濃度的荔枝果肉各酚類成分群的FRAP抗氧化能力Fig. 3 FRAP antioxidant activity of different phenolic compound fractions from litchi pulp in different concentrations

2.4 荔枝果肉各酚類成分群的DPPH自由基清除能力

由表3可知，荔枝果肉各酚類成分群對DPPH自由基均有消除能力，且在一定的濃度范圍內呈顯著劑量效應關系，當濃度進一步增大時，DPPH自由基清除率達到最大值而趨于平緩。數據顯示荔枝果肉各酚類成分群對DPPH自由基最大清除率均約為90%。當質量濃度為30 μg·mL-1時，F2成分群對DPPH·清除率為91.86%，其值在4個成分群中最大，具有良好的DPPH·清除能力；F4對DPPH·清除率為87.95%，接近最大值；而F3和F1的清除率僅分別為72.26%、55.09%。當質量濃度增加到60 μg·mL-1時，F3和F1才逐漸達到最大清除率。此時選擇半抑制率濃度IC50可以更客觀地反映4個酚類成分群的抗氧化能力大小，IC50值越小，表明樣品抗氧化能力越強。經Probit回歸分析求得各成分群清除DPPH·的IC50值分別為27.00、9.76、19.41、16.25 μg·mL-1，四者之間具有顯著性差異（P＜0.05），其中F2的IC50值最小，F1的IC50值最大，后者約為前者的2.77倍。因此，在低于30 μg·mL-1質量濃度下，4個成分群的DPPH·清除率能力大小順序為F2＞F4＞F3＞F1。

2.5 荔枝果肉各酚類成分群的ORAC抗氧化能力

由圖4可知，各酚類成分群表現出的ORAC值差異顯著（P＜0.05），介于（3.61±0.22）—（8.36±0.45）mmol TE·g-1DW。其中F2成分群的ORAC值最大，較F3的ORAC值（（5.88±0.34）mmol TE·g-1DW）高約20%，是F4（（4.84±0.24）mmol TE·g-1DW）的1.59倍，是F1 ORAC值的1.95倍。因此，4個成分群中，F2的ORAC抗氧化能力最強，其次是F3和F4，F1的活性最弱。另外，F2對荔枝果肉總多酚的ORAC值（5.04±0.23 mmol TE·g-1DW）的百分比貢獻率高達50.42%；F1的貢獻率最小，僅為13.40%；F3和F4的貢獻率相近，分別為19.59%和18.61%。

表3 不同質量濃度的荔枝果肉各酚類成分群對DPPH·的清除作用Table3 Scavenging capacities for DPPH· of different phenolic compound fractions from litchi pulp in different concentrations

圖4 荔枝果肉各酚類成分群的ORAC值和百分比貢獻率比較Fig. 4 ORAC value and percentage contribution of different phenolic compound fractions from litchi pulp

2.6 荔枝果肉各酚類成分群的細胞抗氧化能力（CAA）

細胞抗氧化能力（CAA）可以從細胞水平上反映抗氧化物質的吸收、代謝和分布情況，是一種能有效預測植物化學物質在生物系統中抗氧化活性的評價方法。該方法與傳統的化學分析方法相比更具有生物相關性；與動物試驗和臨床研究相比更經濟、快捷［20］。

由圖5可知，4個酚類成分群的EC50值介于（30.00±2.74）—（130.96±15.73）μg·mL-1。其中F2成分群的EC50值最小，其次是F3（（80.30±4.31）μg·mL-1）和F4（（115.60±1.15）μg·mL-1），F1具有最大的EC50值。CAA抗氧化能力結果顯示，F1和F4的CAA值相近，差異不顯著，分別為（43.90±5.43）μmol QE·g-1DW和（47.52±0.47）μmol QE·g-1DW，且兩者的CAA值最低；其次是F3，其值為（68.55±3.78）μmol QE·g-1DW，較F4的CAA值高約44%；F2的CAA值為（190.71±16.57）μmol QE·g-1DW，顯著高于其他3個成分群（P＜0.05），是F3 CAA值的2.78倍，是F1、F4的約4倍。比較各成分群的EC50值和CAA值，可以看出兩者呈負相關，EC50值越小，則表示CAA值越大，即細胞抗氧化活性越強。因此，荔枝果肉4個酚類成分群的細胞抗氧化活性的大小為F2＞F3＞F4、F1。此外，荔枝果肉多酚總提取物的EC50和CAA值分別為（64.56±3.87）μg·mL-1和（81.08±4.29）μmol QE·g-1DW，F2的CAA值對荔枝果肉總多酚的CAA值的貢獻率達到84.91%，其余3個成分群的貢獻率均約為10%。可見，F2是荔枝果肉多酚細胞抗氧化活性的最主要成分群。

圖5 荔枝果肉各酚類成分群的EC50值和CAA值及其CAA的百分比貢獻率Fig. 5 EC50and CAA values and their percentage contribution of different phenolic compound fractions from litchi pulp

3 討論

3.1 荔枝果肉單體酚組成的分離與鑒定

目前關于荔枝果肉多酚的分離純化的研究較少。蘇東曉等［21］采用大孔樹脂吸附法對荔枝果肉多酚進行分離純化，提高了荔枝果肉多酚的純度，而該方法大多是用來去除粗提物中多糖和部分蛋白質雜質，卻無法對物質組分進行有效分離。張粹蘭等［22］采用5種不同極性的溶劑分部萃取荔枝果肉多酚以達到不同酚類物質的分離，但某些物質在不同極性溶劑中都有一定溶解，造成不同萃取級分間物質組分交叉重復。研究表明，硅膠柱層析法可以實現物質高純度、高效的分離，已廣泛用于天然產物的分離純化。WANG等［23］為了分離得到荔枝果核單體酚，利用硅膠層析柱將荔枝果核多酚提取物進行分離，得到8個成分群。JIANG等［24］亦為鑒定荔枝果皮單體酚組成，利用硅膠層析柱將荔枝果皮多酚提取物進行分離，得到10個成分群。因此，本研究選用C18硅膠柱層析分離技術將荔枝果肉中的不同酚類物質進行分離，采用極性從大到小的流動相梯度洗脫，荔枝果肉各酚類物質依次流出，分段收集，得到4個組成基本無重疊的成分群，避免了簡單常用的溶劑分步萃取法造成物質組分交叉重復的現象［25］。

研究報道，鐘慧臻等［26］通過LC-ESI-MS手段檢測到荔枝果肉中可能含有表兒茶素、原花青素B2、原花青素三聚體、原花青素二聚體、槲皮素-蕓香糖-鼠李糖苷、蘆丁及其同分異構體、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷等多種單體酚。Lü等［27］亦采用相同手段從荔枝果肉中檢測到13種單體酚，可能為原花青素B2、表兒茶素、A型原花青素三聚體、B型原花青素三聚體、槲皮素-蕓香糖-鼠李糖苷、蘆丁異構體、山奈酚-蕓香糖-鼠李糖苷、異鼠李素-蕓香糖-鼠李糖苷、蘆丁、B型原花青素二聚體、原花青素A2、山奈酚-蕓香糖苷和異鼠李素-蕓香糖苷。然而，這些研究均未從荔枝果肉中分離純化出單體酚組分，也未通過紫外、紅外、質譜和核磁等手段進行確證。本研究從荔枝果肉分離純化出3種單體酚組分，經ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR和HMBC譜鑒定為表兒茶素、槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷和蘆丁，分別存在于成分群F2、F3和F4中，但仍然有一些主要的單體酚未確證其化學結構。基于前人研究結果，推測荔枝果肉可能還含有A型或B型原花青素三聚體、山奈酚-蕓香糖-鼠李糖苷、異鼠李素-蕓香糖-鼠李糖苷、異鼠李素-蕓香糖苷等單體酚。另外，根據各酚類物質保留時間特征分析發現，酚酸類化合物的出峰時間較早，原花青素三聚體的出峰時間僅次于表兒茶素，山奈酚-3-O-蕓香糖苷和異鼠李素-3-O-蕓香糖苷等黃酮苷出峰時間則更晚［28］。鑒于此，荔枝果肉分離得到的4個酚類成分群中，F1所含物質的出峰時間最早，可能是一些酚酸類化合物；F2中除原花青素B2和表兒茶素外，可能還含有原花青素三聚體；F4中物質的出峰時間最晚，可能是山奈酚-蕓香糖-鼠李糖苷、異鼠李素-蕓香糖-鼠李糖苷、異鼠李素-蕓香糖等黃酮苷類物質。然而，這些化合物的結構特征未通過核磁等手段完全確證，有待進一步探究。另外，F2作為荔枝果肉多酚最主要的活性組分，進一步弄清楚其所含原花青素種類、分子量和聚合度等將能提高其利用價值。

3.2 荔枝果肉抗氧化活性與其酚類物質的關系

FRAP和DPPH是體外評價活性物質抗氧化能力的常見方法，操作簡便；ORAC是目前國際上常用的一種評價食品抗氧化能力的方法，較一般的自由基清除法更準確靈敏［29］；CAA是一種生物評價方法，較化學抗氧化方法具有一定的優越性。選用這四種抗氧化活性評價方法可全面反映荔枝果肉4個酚類成分群的抗氧化活性差異。在4種抗氧化體系中，F2成分群均呈現良好的抗氧化能力，但相較之下，其CAA抗氧化能力更為顯著；而F4的CAA抗氧化能力弱于它在另外3個抗氧化體系中的表現，可能是因為F4所含的蘆丁等黃酮苷類物質溶解性差而不易被細胞吸收，無法發揮細胞內抗氧化作用［30］。可見，不同的抗氧化體系可明顯地影響酚類等活性物質的抗氧化活性大小。

荔枝果肉4個酚類成分群在各評價體系中的抗氧化能力有所差異，綜合來看，4個成分群的抗氧化活性大小為F2＞F3＞F4＞F1。從酚類含量來看，各成分群中總酚和總黃酮含量大小也為F2＞F3＞F4＞F1。可見，抗氧化能力與總酚含量正相關，這與SUN等［31］的結論基本一致。從酚類成分來看，F2主要為原花青素類，據報道，該類化合物是一種天然的自由基清除劑和抗氧化劑，因此其抗氧化活性最強。F3是槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷單體酚。SU等［12］采用ORAC和CAA的方法研究比較該單體酚與表兒茶素、蘆丁及槲皮素的抗氧化活性大小，發現槲皮素-3-O-蕓香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷的ORAC值最大，CAA活性弱于槲皮素，但明顯強于表兒茶素和蘆丁，且數據顯示其CAA值比被廣泛研究報道的咖啡酸、兒茶素和阿魏酸等單體酚的CAA值都高。可見，F3具有良好的抗氧化活性。然而，F3的DPPH·消除能力弱于F4，這可能與兩個成分群所含物質種類不同有關。有研究發現在DPPH抗氧化體系中，原花青素二聚體相比沒食子酸、表兒茶素、槲皮素等常見酚類物質，因其含有更多的活性羥基而具有更強的自由基消除能力［32］。F4的縮合單寧含量較F3高，可能含有某些原花青素類物質，如原花青素A2、B型原花青素二聚體等，而F3僅含一種黃酮醇單體酚，因此所含成分的不同可能是F4的DPPH自由基消除能力強于F3的原因。這說明物質的抗氧化活性大小既與物質的組成有關，也與抗氧化體系有關［33］。因此，在比較多種活性物質的抗氧化活性大小時，應結合物質的組成特點選擇最佳的抗氧化評價方法。

4 結論

本研究采用C18硅膠柱將荔枝果肉多酚提取物分離后得到了4個不同的酚類成分群，分析比較各酚類成分群的總酚、總黃酮和縮合單寧含量及抗氧化活性差異。結果表明，F2成分群的得率最高，總酚、總黃酮和縮合單寧含量最高，其對荔枝果肉總多酚含量的貢獻率也最大；在4種抗氧化體系中，F2成分群的抗氧化能力均顯著高于其他3個成分群，尤其是其CAA抗氧化能力，對荔枝果肉總多酚的CAA貢獻率高達84.91%，而ORAC值的貢獻率也達到50.42%，均高于其他3個成分群對荔枝果肉抗氧化能力的貢獻率之和。因此，F2所含的成分如原花青素B2、表兒茶素、原花青素三聚體等可能是荔枝果肉抗氧化活性的最主要酚類物質。

［1］ 葉延瓊， 章家恩， 呂建秋， 蔣艷萍， 李逸勉. 廣東省荔枝產業發展現狀與對策分析. 中國農學通報， 2011， 27（3）: 481-487.

YE Y Q， ZHANG J E， LV J Q， JIANG Y P， LI Y M. Analysis on the development status and countermeasures of lychee industry in Guangdong province. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2011，27（3）: 481-487. （in Chinese）

［2］ KHAN I U， ASGHAR M N， IQBAL S， BOKHARI T H. Radical scavenging and antioxidant potential of aqueous and organic extracts of aerial parts of Litchi chinensis Sonn. Asian Journal of Chemistry，2009， 21（7）: 5073.

［3］ SAXENA S， HAJARE S N， MORE V， KUMAR S， WADHAWAN S，MISHRA B B， SHARMA A. Antioxidant and radioprotective properties of commercially grown litchi （Litchi chinensis） from India. Food Chemistry， 2011， 126（1）: 39-45.

［4］ BHOOPAT L， SRICHAIRATANAKOOL S， KANJANAPOTHI D，TAESOTIKUL T， THANANCHAI H， BHOOPAT T. Hepatoprotective effects of lychee （Litchi chinensis Sonn.）: A combination of antioxidant and anti-apoptotic activities. Journal of Ethnopharmacology， 2011， 136（1）: 55-66.

［5］ YANG C S， SANG S， LAMBERT J D， LEE M J. Bioavailability issues in studying the health effects of plant polyphenolic compounds. Molecular Nutrition & Food Research， 2008， 52（1）， 139-151.

［6］ BRAT P， GEORGé S， BELLAMY A， Du CHAFFAUT L，SCALBERT A， MENNEN L， AMIOT M J. Daily polyphenol intake in France from fruit and vegetables. The Journal of Nutrition， 2006，136（9）: 2368-2373.

［7］ DUAN X W， JIANG Y M， SU X G， ZHANG Z Q， SHI J. Antioxidant properties of anthocyanins extracted from litchi （Litchi chinenesis Sonn.） fruit pericarp tissues in relation to their role in the pericarp browning. Food Chemistry， 2007， 101（4）: 1365-1371.

［8］ SUN J， JIANG Y M， SHI J， WEI X Y， XUE S J， SHI J Y， YI C. Antioxidant activities and contents of polyphenol oxidase substrates from pericarp tissues of litchi fruit. Food Chemistry， 2010， 119（2）: 753-757.

［9］ LIU L， XIE B J， CAO S Q， YANG E N， XU X Y. Guo S S. A-type procyanidins from litchi chinensis pericarp with antioxidant activity. Food Chemistry， 2007， 105（4）: 1446-1451.

［10］ ZHOU H C， LIN Y M， LI Y Y， LI M， WEI S D. Antioxidant properties of polymeric proanthocyanidins from fruitstones and pericarps of Litchi chinensis Sonn. Food Research International， 2011， 44（2）: 613-620.

［11］ SU D， ZHANG R， HOU F， ZHANG M， GUO J， HUANG F， DENG Y，WEI Z. Comparison of the free and bound phenolic profiles and cellular antioxidant activities of litchi pulp extracts from different solvents. BMC Complementary and Alternative Medicine， 2014， 14（1）: 1.

［12］ SU D， TI H， ZHANG R， ZHANG M， WEI Z， DENG Y， GUO J. Structural elucidation and cellular antioxidant activity evaluation of major antioxidant phenolics in lychee pulp. Food Chemistry， 2014，158: 385-391.

［13］ 楊華， 齊煉文， 李會軍， 李萍. 以“等效成分群”為標示量的中藥質量控制體系的構建. 世界科學技術: 中醫藥現代化， 2014（3）: 510-513.

YANG H， QI L W， LI H J， LI P. Construction of the traditional Chinese medicine quality control system with “equivalent element group” for the labeled amount. The World Science and Technology: Modernization of Traditional Chinese Medicine， 2014（3）: 510-513. （in Chinese）

［14］ ZHANG R， ZENG Q， DENG Y， ZHANG M， WEI Z， ZHANG Y，TANG X. Phenolic profiles and antioxidant activity of litchi pulp of different cultivars cultivated in southern China. Food Chemistry， 2013，136（3）: 1169-1176.

［15］ DEWANTO V， WU X， ADOM K K， LIU R H. Thermal processing enhances the nutritional value of tomatoes by increasing total antioxidant activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002， 50（10）: 3010-3014.

［16］ 孫蕓， 谷文英. 硫酸-香草醛法測定葡萄籽原花青素含量. 食品與發酵工業， 2003， 29（9）: 43-46.

SUN Y， GU W Y. Determination of procyanidin content in grape seed using H2SO4-Vanillin assay. Food and Fermentation Industries， 2003，29（9）: 43-46. （in Chinese）

［17］ XU B J， CHANG S K C. A comparative study on phenolic profiles and antioxidant activities of legumes as affected by extraction solvents. Journal of Food Science， 2007， 72（2）: 159-166.

［18］ EBRAHIMZADEH M A， NABAVI S M， NABAVI S F，BAHRAMIAN F， BEKHRADNIA A R. Antioxidant and free radical scavenging activity of H. officinalis L. var. angustifolius， V. odorata， B. hyrcana and C. speciosum. Pakistan Journal of Agricultural Sciences，2010， 23（1）: 29-34.

［19］ WOLFE K L， KANG X， HE X， DONG M， ZHANG Q， LIU R H. Cellular antioxidant activity of common fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2008， 56（18）: 8418-8426.

［20］ LIU R H， FINLEY J. Potential cell culture models for antioxidant research. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2005， 53（10）: 4311-4314.

［21］ 蘇東曉， 張瑞芬， 張名位， 黃菲， 魏振承， 張雁， 遆慧慧， 鄧媛元，唐小俊. 荔枝果肉酚類物質大孔樹脂分離純化工藝優化. 中國農業科學， 2014， 47（14）: 2897-2906.

SU D X， ZHANG R F， ZHANG M W， HUANG F， WEI Z C， ZHANG Y， TI H H， DENG Y Y， TANG X J. Separation and purification of polyphenol in litchi pulp by macroporous resin. Scientia Agricultura Sinica， 2014， 47（14）: 2897-2906. （in Chinese）

［22］ 張粹蘭， 張名位， 廖森泰， 魏振承， 張雁， 唐小俊， 張瑞芬， 鄧媛元.荔枝果肉不同極性多酚提取及其抗氧化活性比較. 華南師范大學學報（自然科學版）， 2011（4）: 116-120.

ZHANG C L， ZHANG M W， LIAO S T， WEI Z C， ZHANG Y， TANG X J， ZHANG R F， DENG Y Y. Extraction and antioxidant activity of different polarity polyphenols of litchi pulp. Journal of South China Normal University （Natural Science Edition）， 2011（4）: 116-120. （in Chinese）

［23］ WANG L， LOU G， MA Z， LIU X. Chemical constituents with antioxidant activities from litchi （Litchi chinensis Sonn.） seeds. Food Chemistry， 2011， 126（3）: 1081-1087.

［24］ JIANG G， LIN S， WEN L， JIANG Y， ZHAO M， CHEN F， PRASAD K N， DUAN X， YANG B. Identification of a novel phenolic compound in litchi （Litchi chinensis Sonn.） pericarp and bioactivity evaluation. Food Chemistry， 2013， 136（2）: 563-568.

［25］ LABARBE B， CHEYNIER V， BROSSAUD F， SOUQUET J M，MOUTOUNET M. Quantitative fractionation of grape proanthocyanidins according to their degree of polymerization. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1999， 47（7）: 2719-2723.

［26］ 鐘慧臻， 徐玉娟， 李春美， 溫靖， 廖森泰， 陳衛東. 高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜法測定荔枝果肉中酚類物質. 廣東農業科學，2010， 37（4）: 11-14.

ZHONG H Z， XU Y J， LI C M， WEN J， LIAO S T， CHEN W D. Analysis of phenolic compounds in pulp of litchi by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Guangdong Agricultural Sciences， 2010， 37（4）: 11-14. （in Chinese）

［27］ Lü Q， SI M， YAN Y， LUO F， HU G， WU H， CHEN K. Effects of phenolic-rich litchi （Litchi chinensis Sonn.） pulp extracts on glucose consumption in human HepG2 cells. Journal of Functional Foods， 2014， 7: 621-629.

［28］ PRODANOV M， GARRIDO I， VACAS V， LEBRóN-AGUILAR R，DUE?AS M， GóMEZ-CORDOVéS C， BARTOLOMé B. Ultrafiltration as alternative purification procedure for the characterization of low and high molecular-mass phenolics from almond skins. Analytica Chimica Acta， 2008， 609（2）: 241-251.

［29］ DUDONNE S， VITRAC X， COUTIERE P， WOILLEZ M， & MéRILLON J M. Comparative study of antioxidant properties and total phenolic content of 30 plant extracts of industrial interest using DPPH， ABTS， FRAP， SOD， and ORAC assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2009， 57（5）: 1768-1774.

［30］ WOLFE K L， LIU R H. Structure-activity relationships of flavonoids in the cellular antioxidant activity assay. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2008， 56（18）: 8404-8411.

［31］ SUN J， JIANG Y， SHI J， WEI X， XUE S J， SHI J， YI C. Antioxidant activities and contents of polyphenol oxidase substrates from pericarp tissues of litchi fruit. Food Chemistry， 2010， 119（2）: 753-757.

［32］ VILLANO D， FERNáNDEZ-PACHóN M S， MOYá M L，TRONCOSO A M， GARCíA-PARRILLA M C. Radical scavenging ability of polyphenolic compounds towards DPPH free radical. Talanta， 2007， 71（1）: 230-235.

［33］ THAIPONG K， BOONPRAKOB U， CROSBY K， CISNEROSZEVALLOS L， BYRNE D H. Comparison of ABTS， DPPH， FRAP，and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts. Journal of Food Composition and Analysis， 2006， 19（6）: 669-675.

（責任編輯 趙伶俐）

Separation and Antioxidant Activity of Different Phenolic Compound Fractions from Litchi Pulp

DONG Li-hong1，2， ZHANG Rui-fen1， XIAO Juan1， DENG Yuan-yuan1， ZHANG Yan1， LIU Lei1， HUANG Fei1，WEI Zhen-cheng1， ZHANG Ming-wei1
（1Sericultural and Agri-Food Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Food，Ministry of Agriculture/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing， Guangzhou 510610；2Department of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070）

【Objective】The total phenolics， total flavoniods and tannin content and antioxidant activity of different phenolic compound fractions from litchi pulp were compared to clarify the effective phenolic compounds of antioxidant activity from litchi pulp. The results of research will provide a basis for revealing the main compounds from litchi pulp to human health.【Method】Litchi pulp polyphenol extracts were divided into four phenolic compound fractions （F1， F2， F3 and F4） by C18 silica gel column. Then the total phenolics， total flavonoids and tannin content and the compositions of free phenol of four compound fractions were determined. Also， the FRAP， DPPH， ORAC and CAA antioxidation indexes were adopted to evaluate the antioxidant capacities of four different compound fractions.【Result】The results showed that litchi pulp polyphenol extracts were well-divided into four phenolic compound fractions. Among them， the yield of F2 was as high as 36%， and others’ were 18.71%， 16.79% and 21.12%， respectively. Total phenolics， total flavonoids and tannin content of four phenolic compound fractions ranged from 218.86 to 499.78 mg GAE/g DW，414.94 to 1 285.45 mg RE·g-1DW and 83.35 to 483.43 mg CE·g-1DW， respectively. Among the four compound fractions tested， F2 exhibited the highest total phenolics， total flavonoids and tannin content with their corresponding percentage contribution as high as 50.31%， 54.24% and 72.06% to litchi pulp polyphenol extracts， followed by F3， F4， and finally F1. Procyanidin B2 and epicatechin in F2， quercetin-3-O-rutinoside-7-O-α-L-rhamnoside in F3 and rutin in F4 were identified by HPLC. The results of antioxidation indexes showed that FRAP values of four compound fractions were F2＞F3＞F4＞F1. The IC50values of DPPH free radical scavenging were 27.00， 9.76， 19.41 and 16.25 μg·mL-1， respectively， then F2 exhibited the strongest DPPH free radical scavenging ability with minimum IC50value among the four compound fractions， followed by F4， F3， and finally F1. Also， the ORAC values of them were F2＞F3＞F4＞F1 and the CAA values were F2＞F3＞F4， F1. Among them， F2 exhibited the highest ORAC and CAA values as 8.36 mmol TE·g-1DW and 190.71 μmol QE·g-1DW with the percentage contribution as high as 50.42% and 84.91% to total ORAC and CAA values of litchi pulp polyphenol extracts， respectively.【Conclusion】These results indicated that there were significant differences in total phenolics， total flavonoids and tannin content and antioxidant activity among the four phenolic compounds fractions from litchi pulp. The compositions of each phenolic compound fraction were also different. What’s more， F2 exhibited the highest yield， total phenolics， total flavonoids and tannin content with the best antioxidant capacities. Interestingly， the phenolics in F2 may be the most main active compounds of antioxidant activity from litchi pulp.

litchi pulp； polyphenols； separation； compound fractions； antioxidant activity

2016-03-15；接受日期：2016-07-29

國家自然科學基金（31571828）、國家自然科學基金-廣東聯合基金（U1301211）

聯系方式：董麗紅，E-mail：dolify@163.com。通信作者張名位，E-mail：mwzhh@vip.tom.com