植物丙二醛含量測定試驗設計方案

李子芳+吳錫冬

摘 要：針對干旱脅迫對植物丙二醛和蛋白質含量的影響試驗進行了試驗設計，初步得出了一套可行的方案，并從試驗步驟、試驗項目的特色或創新、試驗可行性分析等幾個方面進行了詳細論述，以便統籌試驗并為學生的具體操作提供理論指導。

關鍵詞：試驗設計方案；丙二醛；蛋白質

中圖分類號：Q94-3 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.011

Abstract： The experimental design was carried out for measuring the effect of drought stress on the content of malondialdehyde and protein of plants. A feasible rough plan was made. It discussed the procedure， item feature， and feasibility analysis of the experiment. Therefore， the overall experiment was ready for the concrete details.

Key words： experimental design scheme； malondialdehyde； protein

干旱脅迫可使植物脫水，并破壞細胞膜結構，形成膜脂過氧化。通過測定丙二醛（MDA）含量可了解膜脂過氧化的程度，間接反映膜系統受損程度以及植物的抗逆性。

傳統檢測MDA含量試驗測得的數據，既受學生動手能力的影響，又受測定方式的局限，因此，很難真實有效。本項目擬采用測定方式嚴謹，在科研中廣泛采用的南京建成試劑盒，使試驗條件更易控制，數據更為準確；針對細胞破碎程度不同，在試驗中引入蛋白質含量的測定，排除誤差干擾；使學生參與從植物脅迫、試劑配制到細胞破碎、反應及數據采集等一系列操作過程中，提高學生參與試驗的整體性。通過這一系列的手段，激發學生對試驗的參與熱情，提升科研認知度，提高動手能力和創新意識[1-3]。

1 試驗方案設計

1.1 試驗設置及樣品數

本試驗共計6學時，每4位同學1組，每組同學檢測兩種植物的正常及干旱脅迫樣品，每個樣品3次重復。

1.2 試驗材料的培養與處理

選用吊蘭和穿心蓮兩種較常見的觀葉植物作為試驗材料，以幼莖或分蘗在幾種培養基質中進行生根。結果表明，珍珠巖的吸水力較好，植物生根最多。

植株培養1個月后，將其分為兩類，一類做干旱處理，基質含水量保持在10%左右，另一類正常給水作為對照。這兩類植物在培養7～10 d后即可作為試驗對象使用。

1.3 試驗前期準備及課后調查

要求學生仔細閱讀試劑盒說明書，并作好預習報告；在試驗前熟悉各種儀器的操作方法，如移液器、渦旋混合器、離心機及分光光度計等，并通過多次練習達到準確使用的目的。

學生自行準備試驗材料和配制試劑，教師僅進行必要的指導。

課后通過不記名的方式請學生寫下對該試驗項目的建議和意見，以便于試驗的改進。

1.4 操作步驟

1.4.1 酶液制備 參考文獻[4]的方法，各植株均取用同一部位的老葉作為待測樣品。將各樣品洗凈后，分別稱取0.2 g置于預冷的研缽中，加入液氮研磨成粉末，再放入2 mL 50 mmol·L-1預冷的磷酸緩沖液，轉入離心管中在4 ℃、12 000 r·min-1下離心20 min，上清液即為待測酶液。

1.4.2 MDA含量測定 參考文獻[5]的方法，每組樣品取3支一次性試管，按表1取用各試劑并用旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺一小孔，在95 ℃水浴鍋中水浴40 min，樣品取出后流水冷卻，然后在4 000 r·min-1下離心10 min。提取上清液，用分光光度計在波長532 nm處測定各管吸光度值。

按下列公式計算組織中MDA含量：

組織中MDA含量（nmol·mg-1蛋白）=（測定OD值-空白OD值）/（標準OD值-空白OD值）×標準品濃度（10 nmol·mL-1）/待測樣本蛋白濃度（mg蛋白/mL蛋白）

1.4.3 蛋白定量測定 參考文獻[6]的方法，每組樣品取3支一次性試管，按表2取用各試劑并混勻，靜置10 min，用分光光度計在波長595 nm處測定各管吸光度值。

按下列公式計算組織中的蛋白含量：

待測樣本蛋白濃度（g·L-1）=（測定OD值-空白OD值）/（標準OD值-空白OD值）×標準品濃度（0.563 g·L-1）

2 試驗結果

每個試驗小組的測定結果均重復性較高，且趨勢一致。

通過各組數據統計及計算表明，干旱脅迫均對吊蘭和穿心蓮兩種植物的丙二醛和蛋白質含量造成了影響，其含量均有一定程度的增加。其中，吊蘭的丙二醛含量較穿心蓮低而蛋白質含量則較高，說明吊蘭的耐旱品質要較穿心蓮為高。

3 試驗方案可行性分析

（1）試驗對象為幾種常見的室內觀葉植物，取材方便，樣本量大。預備試驗已用陶土、珍珠巖、石英砂等物質為培養基質，摸索出了較適宜進行干旱脅迫的方式；并通過不同時間的干旱處理，確定了最佳干旱處理期限。

（2）與項目組成員探討如何合理有序地安排試驗進度。使學生既能從容操作，不因試驗過于緊張而造成失誤，又不會使試驗安排松散，分散精力。

（3）在試驗過程中，使學生的樣本取用位置一致，設立對照和重復，排除試驗誤差。樣品提取充分，能正確測定植物的丙二醛和蛋白質含量。

（4）提交試驗的預習和試驗報告，完整再現試驗的準備和測定過程。根據試驗結果，分析植物的膜脂過氧化程度。指出試驗中應注意的事項，對試驗中存在的潛在問題加以討論。

4 結論與討論

該試驗方案的特色與創新為：（1）在試驗的每一個過程中都由學生團隊合作完成，教師僅對學生進行必要的指導；（2）避免了使用如冰乙酸等傷害刺激性試劑，對操作人員無任何毒害，排除了傳統試驗中沸水浴加熱時間不正確的問題；（3）采用綜合試驗設計方式，將丙二醛含量和細胞破碎程度綜合考量，對兩種植物的膜抗逆性能做出比較，提高了學生的科研認知水平[7-9]。

使用試劑盒來測定植物樣本的丙二醛和蛋白質含量，具有比傳統方法更加簡便、快速，靈敏度和準確性高等優點。盡管在基礎理論知識層面和試驗動手操作技能方面，學生水平會表現出參差不齊[10]，但通過學生課上表現及調查試驗課后的反饋發現，通過課前的充分準備和練習，學生能積極參與試驗并普遍對該試驗認同度較高。學生對精密試驗儀器和高端測定方式感到新奇，因而激發了對試驗的參與熱情，這不僅提升了科研認知度，還在分工協作的過程中提高了動手能力和創新意識。

回顧試驗過程及學生反饋，本次試驗項目的設立是一次積極有益的嘗試，將為以后此類試驗項目的開設打下良好的基礎。

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[6]南京建成生物工程研究所.蛋白定量測試盒說明書：考馬斯亮藍法[EB/OL].[2016-06-16].http：//www.njjcbio.com/uploadfile/product/big/20140217164422992.pdf.

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