維藥野西瓜對膠原誘導型關(guān)節(jié)炎大鼠模型的治療機制研究

李培奇 周文濤 娜爾給扎·艾爾肯 甫拉提·熱西提 褚 冰 陳恒碩 王 雪 周曉濤*

1.新疆醫(yī)科大學厚博學院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院中醫(yī)科，新疆 烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學臨床學院，新疆 烏魯木齊 830054；4.新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830054

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維藥野西瓜對膠原誘導型關(guān)節(jié)炎大鼠模型的治療機制研究

李培奇1周文濤2娜爾給扎·艾爾肯3甫拉提·熱西提4褚 冰1陳恒碩1王 雪1周曉濤4*

1.新疆醫(yī)科大學厚博學院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院中醫(yī)科，新疆 烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學臨床學院，新疆 烏魯木齊 830054；4.新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830054

目的：通過膠原型誘導型關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠模型，初步研究維藥野西瓜對類風濕性關(guān)節(jié)炎的抗炎機制。方法：構(gòu)建II型膠原誘導型關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察維藥野西瓜治療前后CIA大鼠足踝腫脹程度及踝關(guān)節(jié)組織病理的改變；ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α表達水平的變化；免疫組化法檢測大鼠足踝關(guān)節(jié)組織中TNF-α的表達。結(jié)果：維藥野西瓜可有效緩解CIA大鼠關(guān)節(jié)的腫脹情況，減緩組織炎癥發(fā)展；藥物作用25d后，與模型組血清中TNF-α含量(60.8±13.5)ng/mL相比，維藥野西瓜處理組血清中TNF-α的含量(43.9±2.6)ng/mL明顯降低；與模型組相比，維藥野西瓜治療組大鼠足踝關(guān)節(jié)組織中TNF-α的表達也明顯減少。結(jié)論：維藥野西瓜對CIA大鼠具有較好的抗RA作用，其作用機制可能與降低血清及組織中的TNF-α水平有關(guān)。

類風濕性關(guān)節(jié)炎；維藥野西瓜；CIA大鼠模型；TNF-α

類風濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種以累積周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)慢性炎癥性自身免疫疾病，可導致不可逆的關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞，甚至關(guān)節(jié)畸形和殘疾[1]。RA的發(fā)病機制至今仍未證實，近年來研究顯示RA的發(fā)病機制可能與感染、遺傳和內(nèi)分泌等有關(guān)，但臨床上依然缺乏特異性治療措施，尚無治愈方法。維藥野西瓜(Capparis Spinosal)廣泛分布于新疆天山南北，其為新疆維吾爾醫(yī)治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、痛風及瘡毒等疾病的外敷用藥，具有祛風除濕，止痛消痛的作用。研究通過構(gòu)建大鼠Ⅱ型膠原誘導型關(guān)節(jié)炎模型(Type Ⅱ Collagen Induced Arthritis，CIA)，觀察維藥野西瓜外敷法對CIA型關(guān)節(jié)炎大鼠左足踝關(guān)節(jié)腫脹程度、組織病理、細胞因子TNF-α在血清與組織中的表達，對維藥野西瓜抗膠原型關(guān)節(jié)炎大鼠模型的效果及作用機制進行初步探討。

1 儀器與材料

1.1 動物 清潔級雌性Wistar大鼠40只,7～9周齡，體重(200±15)g，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 儀器 游標卡尺(最小刻度為0.2mm，上海精密儀器廠)； Labsystems Dragon wellscanMK3酶標儀。

1.3 材料 維藥野西瓜(新疆新特藥有限公司提供，新疆醫(yī)科大學藥學院生藥系鑒定)；雷公藤多甙片(批號：140701，上海復旦復華藥業(yè)有限公司)；酸溶性型牛Ⅱ膠原(美國Sigma公司)；弗氏完全佐劑(Freund’s Complete Adjuvent，F(xiàn)CA，美國Sigma公司)；ELISA大鼠TNF-α定量試劑盒(ebioscience公司)；anti-TNF-α抗體(武漢博士德公司)；DAB顯色試劑盒(北京金杉公司)。

2 方法

2.1 動物模型的分組、構(gòu)建及給藥 將40只Wistar雌性大鼠隨機分為4組：空白對照組(NS)、模型組、雷公藤甙治療組及野西瓜治療組。根據(jù)參考文獻[2]，配制IFA：完全佐劑 (FCA)石蠟=1∶2，造模前模型組將酸溶性型牛Ⅱ膠原與IFA等體積進行混合、乳化。在大鼠左側(cè)后足跖肉墊處皮內(nèi)注射 0.1mL混懸乳劑致敏，背部皮內(nèi)注射0.05mL混懸乳劑致敏，每天測量足趾腫脹程度，7d后在鼠尾根部注射相同乳劑加強1次。正常對照組在相同的部位注射 0.1mL滅菌石蠟。致敏2周后，成功建立CIA型關(guān)節(jié)炎大鼠模型，參照關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分標準[3]對模型復制效果進行評估，評分達6分以上的大鼠用于實驗。陽性對照組給予雷公藤甙(0.01mg/kg)灌胃治療；治療組為維藥野西瓜粗提取物加白酒及蛋清混勻(45°白酒∶蛋清=1∶2，5%維藥野西瓜打粉粗提物)，用紗布包裹于大鼠左后足踝進行治療，隔日一次換藥；正常對照組及模型組以生理鹽水灌胃，每日一次。

2.2 取材 治療25d后取材，處死大鼠，采取大鼠腹主動脈采血，將其左右足踝關(guān)節(jié)的滑膜組織用10%甲醛溶液進行固定。

2.3 觀察檢測 用游標卡尺每日測量大鼠左后足踝關(guān)節(jié)的上下徑并記錄數(shù)據(jù)，觀察其腫脹程度(精確至0.2mm)；同時鏡下觀察大鼠左后足踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理切片(HE染色)變化，ELISA法觀察血清中TNF-α的變化，免疫組化法觀察足踝關(guān)節(jié)組織TNF-α的表達水平。

2.4 免疫組化結(jié)果評分 采取每張切片隨機觀察具有代表性的10個高倍鏡視野，根據(jù)胞膜胞質(zhì)染色程度及染色細胞百分比進行評分：基本不著色者為0分，著色淡者為1分，著色適中者為2分，著色深者為3分；著色細胞占計數(shù)細胞百分比≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。將每張切片著色程度得分與著色細胞百分比得分相乘為其最后得分，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，≥4分為強陽性(++)。

3 結(jié)果

3.1 對CIA大鼠足踝關(guān)節(jié)腫脹程度的影響 維藥野西瓜對CIA大鼠踝關(guān)節(jié)的急性炎癥反應(yīng)有較好抑制作用。與空白對照組比較，造模后第14天(藥前)各組踝關(guān)節(jié)均明顯腫脹(P<0.01)，表明造模成功。用藥第25天后，雷公藤甙組及維藥野西瓜對大鼠右足踝關(guān)節(jié)腫脹均有明顯的緩解作用(P<0.05)。見表1。

表1 維藥野西瓜外敷法對Ⅱ型膠原誘導型關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度的影響 ±s，n=10)

注：與空白對照組(NS)比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

3.2 組織病理切片觀察 HE染色組織切片鏡下可見，正常組大鼠關(guān)節(jié)組織無淋巴細胞浸潤及毛細血管的增生；CIA大鼠模型組可見到淋巴細胞浸潤，同時滑膜細胞增殖，毛細血管的增生，軟骨組織破壞嚴重；而雷公藤甙治療組和維藥野西瓜外敷組鏡下觀察可見軟骨組織破壞減輕，淋巴細胞浸潤明顯改善。見圖1～4。

3.3 外周血中TNF-α含量變化 由圖5可知，與正常對照組外周血中TNF-α含量(51.8±10.1)ng/mL比較，模型組大鼠外周血中TNF-α含量(60.8±13.5)ng/mL明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=-2.582，P<0.05)。雷公藤甙治療組大鼠外周血中TNF-α含量為(47.5±7.4)ng/mL、維藥野西瓜治療組大鼠外周血中TNF-α含量為(43.9±2.6)ng/mL，均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為-3.265、-2.601，P<0.05)。

3.4 足踝關(guān)節(jié)組織中TNF-α表達水平變化 由圖6可見，CIA關(guān)節(jié)炎大鼠模型組足踝關(guān)節(jié)組織中TNF-α表達明顯升高(Z=-3.00，P<0.05)。與模型組相比，雷公藤甙治療組及維藥野西瓜治療組大鼠踝關(guān)節(jié)組織中TNF-α表達水平明顯下降(Z值分別為-2.449、-2.362，P<0.05)。

4 討論

類風濕性關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)主要為關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥反應(yīng)，該病具有診斷不易，易反復發(fā)作的特點。治療不佳的患者可隨著病情發(fā)展，逐漸侵害關(guān)節(jié)，直至關(guān)節(jié)畸形，甚至功能喪失，因此早期干預有利于延緩病情進展，對改善患者預后具有重要意義[2]。RA從組織病理變化上而言可能涉及關(guān)節(jié)腔滑膜炎癥、細胞增生、炎性細胞浸潤、肉芽腫形成、軟骨及骨組織破壞等多個環(huán)節(jié)，目前尚無特效治療措施[3]。

維吾爾醫(yī)藥用植物野西瓜，因多分布于新疆南北坡地而最早報道于《新疆中草藥》，其維文名為：開派、菠里科果，在沙特阿拉伯做為傳統(tǒng)藥物常被用作治療風濕病、關(guān)節(jié)炎和痛風等；在維吾爾醫(yī)學中，野西瓜被認為具有祛風除濕、散寒除濕、消腫止痛的功效，常被作為治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物。近年來，野西瓜經(jīng)過粗提取后的臨床應(yīng)用已引起國內(nèi)外研究者的關(guān)注。有研究已表明[4]，維藥野西瓜可緩解佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹，降低外周炎性因子的水平。Ⅱ型膠原誘導型關(guān)節(jié)炎模型(type Ⅱ collagen induced arthritis)由Trentham等于1977年首次建立，并隨研究的不斷深入和相關(guān)實驗的大量重復，目前已成為公認的研究人類類風濕關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典模型[5]。CIA模型在病證表現(xiàn)性更加的穩(wěn)定、持久[6]，并更接近于人類的RA模型，具有研究的代表性和經(jīng)典性。實驗依據(jù)參考文獻[2]，免疫2周后成功構(gòu)建CIA大鼠模型。參照關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分標準[7]對模型的復制效果進行評估，評分達6分以上。結(jié)果顯示：與對照組比較，造模后第2周(給藥前)各組踝關(guān)節(jié)均明顯腫脹，CIA大鼠模型制備較為成功(P<0.01)。藥物干預第25天時，模型組CIA大鼠足踝關(guān)節(jié)直徑為(10.05±0.5)mm，雷公藤治療組及野西瓜治療組大鼠足踝關(guān)節(jié)的腫脹程度明顯減輕，分別為(9.33±0.8)mm、(8.72±0.7)mm，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。從組織切片上也可以看出，野西瓜治療組大鼠軟骨組織破壞減輕，淋巴細胞浸潤得到明顯改善。

腫瘤壞死因子(TNF-α)通常由單核細胞及巨噬細胞分泌。做為主要前炎癥因子，TNF-α對關(guān)節(jié)實質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞具有廣泛作用，在形成RA炎癥、新生血管生成和骨質(zhì)減少過程中起著重要作用[8]：TNF-α可促進趨化因子的合成和分泌、增加細胞黏附分子的表達，從而加速淋巴細胞和單核細胞的募集[9]。TNF-α也可促進提呈抗原肽的MHCⅡ類分子表達，通過促進對自身抗原的反應(yīng)激活T細胞，繼而誘導結(jié)締組織細胞，包括滑膜成纖維細胞和軟骨細胞產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，致滑膜炎癥和增生、軟骨破壞[10]。TNF-α還可促進 RA滑膜細胞的凋亡[10]。有研究顯示RA患者血和病變關(guān)節(jié)滑液中 TNF-α水平隨同期關(guān)節(jié)炎活動指數(shù)的改善而顯著下降，使用抗 TNF-α單抗治療后，RA患者病變關(guān)節(jié)內(nèi)的滑膜炎和軟骨破壞得以抑制，患者癥狀體征明顯減輕[10]。實驗中利用ELISA實驗及免疫組化實驗，試圖從血清學水平及組織學水平上分別對CIA大鼠血清及組織中TNF-α的表達情況進行檢測。結(jié)果顯示，藥物處理25天后，正常對照組血清中TNF-α含量為(51.8±10.1)ng/mL，CIA模型組大鼠血清中TNF-α為(60.8±13.5)ng/mL，與正常組相比明顯升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；雷公藤甙治療組大鼠外周血中TNF-α為(47.5±7.4)ng/mL，維藥野西瓜治療組為(43.9±2.6)ng/mL，與CIA模型組相比，兩者均明顯降低(P<0.05)，但兩者之間差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果提示維藥野西瓜可通過降低CIA大鼠血清中TNF-α水平起到抗RA的作用。免疫組化技術(shù)是利用抗原抗體特異性反應(yīng)對組織細胞中的特定抗原(或抗體)進行定位和定性的一種染色技術(shù)，具有直觀的特點。免疫組化實驗結(jié)果顯示CIA模型組大鼠在關(guān)節(jié)滑膜組織上TNF-α表達明顯增高 (P<0.05)；與模型組相比，雷公藤甙治療組及維藥野西瓜治療組大鼠踝關(guān)節(jié)組織中TNF-α表達水平明顯下降 (P<0.05)。ELISA及免疫組化實驗結(jié)果提示抑制血清及足踝關(guān)節(jié)組織中TNF-α的表達可能是維藥野西瓜抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的作用機制之一。

綜上所述，維藥野西瓜可有效減輕CIA大鼠模型的足趾腫脹程度，緩解病理損害，其機制可能與降低血清及組織中的TNF-α水平有關(guān)。RA 的發(fā)病機制目前尚未明確，臨床治療手段較局限，通過現(xiàn)代的研究手段和方法運用，來發(fā)掘特色維藥的獨特治療效果，有利于進一步研究并闡明維藥野西瓜在抗類風濕關(guān)節(jié)炎中的作用及機制，以期在類風濕性關(guān)節(jié)炎的研究及診治上取得新進展。

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(編輯：陶希睿)

Research on the Mechanism of Capparis Spinosalagainst Rheumatoid Arthritis by Collagen Induced Arthritis Rat Model

LI Peiqi1ZHOU Wentao2NARgezha·Arken3FUlati·Rexiti4CHU Bing1CHEN Hengshuo1WANG Xue1ZHOU Xiaotao4*

1.HouBo College of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054,China;2.The Department of Traditional Chinese Medicine in the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054,China；3. Clinical College of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054,China;4.Basic Medical College of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China

Objective To study the mechanism of Capparis Spinosal against rheumatoid arthritis(RA) by the Collagen induced arthritis rat model.Methods After establishing CIA rat model, the Capparis Spinosal’s antiarthritic effects against RA were studied through observing the changes of ankle swelling, pathology of anklebone and observing the levels of TNF-α in serum and tissue after medication. Results Capparis Spinosal could effectively inhibits articular swelling, decrease inflammatory in tissue of CIA rats.After Drugs had been used for 25 days, compared to the content of TNF-α in the serum of the model group ( 60.8±13.5)ng/mL, the content of TNF-α in the serum of the Capparis Spinosal therapy group(43.9±2.6)ng/mL decreased significantly; the expression of TNF-α decreased obviously in the Capparis Spinosal therapy group compare to the model group.Conclusion Capparis Spinosal had antiarthritic effects to CIA rat model, the possible mechanism may be related to the level of TNF-α decreased.

Rheumatoid Arthritis；Capparis Spinosal；Type Ⅱ Collagen Induced Arthritis Rat；TNF-α

2016-08-05

新疆醫(yī)科大學大學生創(chuàng)新課題(CX2015061)；新疆維吾爾自治區(qū)大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(201510760061)；自治區(qū)衛(wèi)生計生委青年科人才專項資金科研項目(2015Y41)。

李培奇(1994-)，男，漢族，本科在讀。E-mail:362496355@qq.com

周曉濤(1981-)，女，漢族，副教授，碩士生導師，主要從事中維醫(yī)藥免疫機制研究。E-mail：xiaotaozhou9@sina.com

R593.22

A

1007-8517(2016)20-0009-04