HPLC法測定睡蓮花中煙花苷和紫云英苷的含量

買吾拉江·阿不都熱衣木 李 倩 王 亮 徐 芳 吉騰飛 趙 軍*

1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆藥物研究所維吾爾藥重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830004；3.中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，北京 100050

?

藥物研究

HPLC法測定睡蓮花中煙花苷和紫云英苷的含量

買吾拉江·阿不都熱衣木1李 倩1王 亮1徐 芳2吉騰飛3趙 軍2*

1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆藥物研究所維吾爾藥重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830004；3.中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，北京 100050

目的：建立睡蓮花中煙花苷和紫云英苷的含量測定方法，為該藥材質(zhì)量標準制定提供依據(jù)。方法：采用HPLC法測定，色譜柱：Phenomenex GeminiC18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：350nm。結果：煙花苷和紫云英苷的線性范圍分別為2.56～76.80 μg(r2=9999)、2.0～60.0 μg(r2=9999)；平均回收率(n=6)分別為100.06%、99.07%。結論：該方法操作簡單、重復性好，可用于控制維吾爾藥睡蓮花的質(zhì)量。

雪白睡蓮；煙花苷；紫云英苷；高效液相色譜

睡蓮花為睡蓮屬多年生水生草本植物雪白睡蓮(NymphaeacandidaPresl)的干燥花蕾，主要分布于我國新疆的伊犁、阿勒泰和博湖地區(qū)[1]。睡蓮花為維吾爾醫(yī)習用藥材，具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神的功效，臨床主要用于熱癥引起的頭痛、熱感咳嗽及小兒急、慢驚風等病癥的治療，收載于《中華人民共和國藥品標準維吾爾藥分冊》中[2]。藥理證實，睡蓮花具有抗氧化、抗炎、降血糖等多種生物活性[3-6]。黃酮類成分煙花苷和紫云英苷是睡蓮花主要的特征性成分[7]。為了更好的控制睡蓮花藥材的質(zhì)量，本研究通過高效液相色譜建立了睡蓮花中煙花苷和紫云英苷的含量測定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 SPD-10Avp高效液相色譜儀(日本島津公司)；AS系列超聲波清洗機(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2 材料 對照品煙花苷(純度98.95%，自制)；紫云英苷(批號：MUST-15080515，成都曼思特生物科技有限公司)。雪白真純凈水(新疆烏魯木齊雪白真純凈水有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、乙醇等有機溶劑均為分析純。睡蓮花藥材購自新疆維吾爾藥業(yè)有限公司，由新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為雪白睡蓮N.CandidaPresl的干燥花蕾。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的煙花苷和紫云英苷對照品適量，加甲醇制成含煙花苷0.256mg/mL和紫云英苷0.200mg/mL的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取睡蓮花適量，粉碎，過50目篩。精密稱取粉末0.1g置25mL量瓶中，加入25mL甲醇，超聲處理 30min后用0.45μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品。

2.3 色譜條件 色譜柱：Phenomenex GeminiC18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫程序(0～25min，18%A～20%A)；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；檢測波長：350nm；進樣量：10μL。在上述色譜條件下對照品及樣品色譜圖見圖 1。

2.4 方法學考察2.4.1 線性關系考察 分別精密移取煙花苷、紫云英苷對照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 、3.0mL于10mL量瓶中，用甲醇定容。按上述色譜條件分別測定峰面積，以峰面積為縱坐標(Y)，進樣量為橫坐標(X)繪制標準曲線，得回歸方程分別為Y=15998603.9797X-517.8301，r2=0.9999，線性范圍為 2.56～76.80μg；Y=20666865.5207X-4227.7851，r2=0.9999，線性范圍為2.0～60.0μgL。

2.4.2 精密度試驗 取混合對照品溶液連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算煙花苷、紫云英苷峰面積的RSD分別為0.91%、1.41%，表明該方法精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 睡蓮花粉末0.1 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備后，分別于0、1、2、4、8、24h 測定，煙花苷、紫云英苷峰面積的RSD分別為1.32%、1.62%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取睡蓮花粉末，按“2.2”項制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，平行操作6份，測得煙花苷、紫云英苷的平均含量分別為4.1554mg/g、1.4396mg/g，RSD分別為1.51%、1.93%。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取已測定的睡蓮花粉末6份，每份約0.05g，分別精密加入0.256mg/mL煙花苷對照品溶液1.5mL、0.200mg/mL紫云英苷對照品溶液0.97mL，加入甲醇20mL，超聲處理30min后定容至25mL，過0.45μm 的微孔濾膜，按上述色譜條件測定，以外標法計算回收率。結果煙花苷、紫云英苷平均回收率分別為100.06%、99.07%，RSD分別為0.93%、1.54%。見表 1。

表1 睡蓮花中煙花苷和紫云英苷回收率測定結果

2.5 樣品含量測定 精密稱取3份睡蓮花粉末各0.1g，按“2.2”項所述方法制備，精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀進行測定，計算煙花苷和紫云英苷的含量。結果顯示睡蓮花藥材中煙花苷的含量為(5.31±0.03)mg/g，紫云英苷含量為(1.60±0.01)mg/g。

3 討論

本實驗通過HPLC法建立了同時測定睡蓮花中煙花苷和紫云英苷的方法。在測定過程中，考察了不同濃度的甲醇對兩種成分的提取效率，結果發(fā)現(xiàn)高濃度的甲醇提取效率最高，因此選擇甲醇作為提供溶劑。經(jīng)方法學考察，證明該方法簡便易行、重復性好，可為睡蓮花藥材質(zhì)量控制方法的建立提供依據(jù)。

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部中國藥典委員會.衛(wèi)生部頒標準維吾爾藥分冊[M]. 烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社, 1999：41.

[2]劉勇民. 維吾爾藥志(下)[M]. 烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社, 1999：541.

[3]Zhao J, Liu T, Ma L, et al. Antioxidant and preventive effects of extract from Nymphaea candida flower on in vitro immunological liver injury of rat primary hepatocyte cultures [J]. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine,2009，(10)：1093.

[4]Hsu CL, Fang SC, Yen GC. Anti-inflammatory effects of phenolic compounds isolated from the flowers of Nymphaea mexicana Zucc [J]. Food Function, 2013, 4(8):1216-1222.

[5]Rajagopal K, Sasikala K, Ragavan B. Hypoglycemic and antihyperglycemic activity of Nymphaea stellata flowers in normal and alloxan diabetic rats [J]. Pharmceutical Biology,2008, 46(3): 654-659.

[6]趙軍, 徐芳, 吉騰飛，等. 睡蓮屬植物化學成分及生物活性研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2014,26(1): 141-147.

[7]趙軍, 閆明, 賀金華，等. 維藥睡蓮花中的黃酮醇苷類成分分析[J].中國現(xiàn)代應用藥學雜志, 2018,25(2): 115-117.

(編輯：程鵬飛)

Simultaneous Determination of Nicotiflorin and Astragalin inNymphaeaCandidaby HPLC

Maiwylajiang·Abudureyimu1LI Qian1WANG Liang1XU Fang2JI Tengfei3ZHAO Jun2*

1. College of life Sciences&Technology, Xinjiang University,Urumqi 830046, China;2. Xinjiang Key Laboratory for Uighur Medicines, Xinjiang Institute of Materia Medica,Urumqi 830004, China;3. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100050, China

Objective To establish a method for simultaneous determination of nicotiflorin and astragalin inNymphaeaCandidaby HPLC.Methods The HPLC separation was performed on a Phenomenex Gemini C18column (250mm×4.6mm, 5μm), in gradient elute made with a mixture consisting of acetonitrile and 0.2ml/L H3PO4solution at 30℃, the flow rate was 1.0mL/min,thedetaction wavelength was sat at 350 nm. Results The linear relationship of nicotiflorin and astragalin were 2.56～76.80 μg(r2=9999), 2.0～60.0μg(r2=9999). The average recovery rate were 100.06%, 99.07%(n=6), respectively. Conclusion The method is simple,accurate and reproducible and can be used for quality control ofNymphaeaCandidaPresl.

NymphaeaCandida;Nicotiflorin and Astragalin;HPLC

2016-07-20

新疆維吾爾自治區(qū)科技支撐計劃項目(201333118)。

買吾拉江·阿不都熱衣木(1991-)，男，維吾爾族，碩士研究生在讀，研究方向為食藥廉用植物研發(fā)。E-mail:1484077939@qq.com

趙軍( 1973-), 男, 研究員, 博士, 從事藥食兼用植物的研究與開發(fā)。E-mail:zhaojun21cn@163.com

R284.1

A

1007-8517(2016)20-0020-03