正交實驗法優化番瀉葉的提取工藝*

金施施，牛換云，丁輝，武婕，余河水，李薇，曹滿，宋新波，

（1.天津中醫藥大學，天津　300193；2.天津中一制藥有限公司，天津　300193）

正交實驗法優化番瀉葉的提取工藝*

金施施1，牛換云1，丁輝1，武婕1，余河水1，李薇1，曹滿2，宋新波1，2

（1.天津中醫藥大學，天津300193；2.天津中一制藥有限公司，天津300193）

［目的］優選番瀉葉中番瀉苷的最佳提取工藝。［方法］建立同時測定番瀉葉中番瀉苷A和番瀉苷B含量的方法，以番瀉苷A、B的含量為指標，在單因素考察的基礎上，進行正交實驗優選最佳提取工藝。［結果］番瀉葉中番瀉苷的最佳提取工藝為10倍量0.5%的碳酸氫鈉60℃攪拌提取1 h。［結論］優化后的提取工藝穩定可靠，可為番瀉苷相關研究和實際生產提供依據。

番瀉葉；番瀉苷；番瀉苷A；番瀉苷B；提取工藝

番瀉葉是豆科植物狹葉番瀉（Cassia angustifolia Vahl）或尖葉番瀉（Cassia acutifolia Lelile）的干燥小葉。其性甘、苦、寒，歸大腸經，具有瀉熱行滯、通便、利水之效。用于治療熱結積滯、便秘腹痛、水腫脹滿［1］。近年來，其被廣泛用于直腸檢查、術前清潔腸道以及各種便秘，是全世界應用廣泛的導瀉劑。狹葉番瀉葉含番瀉苷A、B、C、D、蘆薈大黃素雙蒽醌苷、大黃酸葡萄糖苷、蘆薈大黃素-8-葡萄糖苷、大黃酸、蘆薈大黃素［2］。尖葉番瀉葉含番瀉苷A、B、C、蘆薈大黃素-8-葡萄糖苷、大黃酸-1-葡萄糖苷、大黃酸-8-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸［3］。此外，番瀉葉中尚含有大黃酸-8-雙葡萄糖苷、大黃酸蒽醌-8-葡萄糖苷、初級苷［4］。藥理研究表明，番瀉葉致瀉的有效成分為蒽苷，其主要瀉下成分為番瀉苷A、B，番瀉苷A、B在腸道多種細菌的作用下，通過不同的代謝途徑，降解為大黃酸蒽酮，產生緩瀉作用。此外番瀉葉還具有止血、肌肉松馳與解痙以及抗胃黏膜損傷等作用［5］。番瀉葉可刺激盆腔神經，并使盆腔器官充血，故月經期及妊娠婦女慎用或忌用。長期、大劑量服用番瀉葉及其制劑能引起腸黏膜損傷及腸道神經組織的損傷，有一定成癮性［6］及肝毒性［7］。傳統對番瀉葉的提取方法主要有：沸水煎煮、沸水浸泡、醇回流及超聲提取等，在番瀉葉提取過程中，溫度對番瀉苷有影響，可導致番瀉苷降解。Lainonen等［8］和張陽等［9］研究發現，番瀉苷在高溫下長時間加熱含量大量下降。陳丹丹等［10］研究番瀉苷B的穩定性結果顯示，溫度對番瀉苷B的含量亦有影響。本實驗選取碳酸氫鈉溶液作為提取溶劑，采用攪拌提取法，以番瀉苷A、B的含量為指標，在單因素考察的基礎上，進行正交實驗優選最佳提取工藝，旨在篩選出簡單、高效、穩定、可行的番瀉苷提取方法。

1　儀器與材料

LC-2010 AHT高效液相色譜儀（日本島津公司），色譜柱Megres C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司），磁力攪拌器（北京中西遠大科技有限公司），分析天平（梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司），JD-A-10L超純水儀（北京凈道科技有限公司）。

番瀉葉，購自安國藥材市場，經天津中醫藥大學張麗娟教授鑒定為豆科植物狹葉番瀉（Cassia angustifolia Vahl）的干燥小葉，番瀉苷A標準品（天津一方科技有限公司，批號20121096，純度大于98%）、番瀉苷B標準品（天津一方科技有限公司，批號20121100，純度大于98%），乙腈（色譜純，美國Fisher Scientific公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2　實驗方法與結果

2.1番瀉苷A和番瀉苷B分析方法的建立

2.1.1色譜條件色譜柱：Megrace C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）。流動相：乙腈（A）與0.7%磷酸-水（B）梯度洗脫，洗脫程序：0～30 min，A 15.5%。30～48 min，A15.5%～30%；48～68min，A30%～58%。流速：1mL/min。檢測波長：254 nm。柱溫：30℃。進樣量：10 μL。在該色譜條件下，基線漂移較小，對照品番瀉苷A和番瀉苷B分離效果較好，色譜峰峰形好，供試樣品色譜峰分布均勻，且保留時間穩定，見圖1。

圖1　混合對照品和供試品色譜圖

2.1.2對照品溶液的制備精密稱取番瀉苷A、番瀉苷B對照品適量，分別置于5mL容量瓶中，加0.1%碳酸氫鈉溶液至溶解完全，定容至刻度，搖勻，分別配制成濃度為223、209 mg/L的對照品溶液，備用。

2.1.3供試品溶液的制備精密稱取番瀉葉中粉2.00 g，置具塞錐形瓶中，精密加入0.1%碳酸氫鈉200 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，補足減失的質量，搖勻，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.2方法學考察

2.2.1線性關系考察分別取番瀉苷A 223 mg/L、番瀉苷B 209 mg/L的對照品儲備液適量，加0.1%碳酸氫鈉稀釋成番瀉苷A：223～13.94 mg/L，番瀉苷B：209～13.1 mg/L的一系列對照品溶液。按2.1色譜條件進行測定，以峰面積積分值為縱坐標（Y），以質量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，回歸方程分別為：番瀉苷A為Y=1 186 373.32X-612.96（r=0.999 9），番瀉苷B為Y=1 148 336.11X-891.45（r=0.999 9）。表明番瀉苷A和番瀉苷B分別在13.9～223 mg/L、13.1～209 mg/L范圍內線性良好。

2.2.2精密度實驗精密吸取番瀉苷A和番瀉苷B混合對照品溶液，進樣10 μL，連續進樣6次，按2.1色譜條件進行測定，計算得峰面積的RSD分別為0.199%、0.26%，表明儀器穩定性良好。

2.2.3重復性實驗取番瀉葉提取物6份，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備樣品，在2.1色譜條件下，測定6份樣品中番瀉苷A、B的含量，計算峰面積的RSD值分別為0.245%、0.267%。

2.2.4穩定性實驗取供試品溶液，分別于制備后2、4、6、8、10、12 h進樣檢測，按2.1色譜條件進行測定，計算峰面積的RSD分別為1.57%、1.66%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.2.5加樣回收率實驗精密稱定同一批番瀉葉樣品6份，每份0.5 g，分別精密加入番瀉苷A標準品36.3 μg，番瀉苷B標品41.5 μg，按供試品溶液制備方法制備樣品，進行測定，計算回收率。所得平均回收率番瀉苷A為97.9%，RSD=1.08%；番瀉苷B為99.4%，RSD=1.73%，表明回收率符合要求。

2.3工藝優化

2.3.1提取溶劑的選擇綜合文獻參考及適合生產應用，選取乙醇、水、碳酸氫鈉3種溶劑進行篩選，取3份番瀉葉中粉各1 g，精密稱定，分別加入50%乙醇、水、碳酸氫鈉各100 mL，稱定質量，分別在相同條件用磁力攪器攪拌提取1 h，放冷，補加溶劑至原質量，取上清液，過0.45 μm濾膜，取續濾液，進樣，檢測。并計算番瀉苷A和番瀉苷B的含量。結果表明碳酸氫鈉提取效果最好，見表1。

表1　不同提取溶劑下的番瀉苷A+番瀉苷B提取量

2.3.2碳酸氫鈉最佳濃度的選擇精密稱取5份番瀉葉中粉各2 g，放入錐形瓶內，分別加入濃度為0.05%、0.1%、0.5%、1%、3%的碳酸氫鈉各200 mL，稱定質量，錐形瓶加蓋密封，相同條件下用磁力攪拌器攪拌提取1 h，放冷，補足質量，取上清液，過0.45 μm濾膜，取續濾液，進樣。測定總番瀉苷A、番瀉苷B的含量。結果表明0.5%碳酸氫鈉提取效果最好，見表2。

表2　不同碳酸氫鈉濃度下的番瀉苷A+番瀉苷B的提取量

2.3.3正交實驗設計在確定了提取溶劑、碳酸氫鈉濃度的基礎上，對影響提取的其他主要因素：提取溫度（A）、提取時間（B）、提取溶劑用量（C）進行正交實驗優選，每次實驗用番瀉葉中粉2 g，采用L9（34）進行正交實驗［11-14］。因素水平設計見表3，結果見表4、表5。

表3　因素水平

表4　直觀分析表

表5　方差分析表

2.3.4結果由直觀分析表可以看出，各因素對番瀉苷A+番瀉苷B提取量的影響大小依次為：B＞A= C，提取時間對提取量影響最明顯，其次是提取溫度和提取溶劑用量，由于番瀉苷在高溫條件下不穩定，所以提取溫度選為60℃，最后優化提取工藝為10倍量0.5%的碳酸氫鈉60℃攪拌提取1 h，該提取工藝與傳統工藝相比，明顯提高了番瀉苷提取率。

2.3.5驗證實驗按照上述確定的工藝，精密稱取番瀉葉中粉200 g，放入燒杯中，加入10倍量的濃度為0.5%的碳酸氫鈉溶液，稱質量，于60℃攪拌提取1 h，放冷，補足質量，過濾，續濾液稀釋5倍，過0.45 μm濾膜，取續濾液，進樣10 μL，計算番瀉苷A、番瀉苷B總含量為2.56 g。

3　討論

番瀉葉的主要瀉下成分為番瀉苷A、B、C、D［15］，番瀉苷A、B互為同分異構體，番瀉苷C、D也互為同分異構體。番瀉苷C經口服后在腸內細菌的作用下，降解產物有蘆薈大黃素蒽酮，蘆薈大黃素蒽酮在多種細胞株的AMES試驗中有遺傳毒性作用［16］。因此本實驗以番瀉苷A、B來計有效成分的含量，較以番瀉苷A或總番瀉苷計有效成分更為合理。

本實驗嘗試了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-三氟乙酸-水、乙腈-三氟乙酸-水、甲醇-磷酸-水、乙腈-磷酸-水系統［17-18］，最終確定了利用乙腈-0.7%磷酸-水作為流動相，此外，還嘗試了不同流速和不同的線性梯度進行洗脫，結果顯示，乙腈-0.7%磷酸-水作為流動相，進行線性梯度洗脫，基線漂移較小，分離效果較好，色譜峰峰形好，分布均勻，且保留時間穩定。

番瀉苷類化合物具有酚羥基和羧基，具有一定酸性，在堿水中成鹽而溶解，因此本實驗選取碳酸氫鈉作為一種提取溶劑，有利于充分提取番瀉苷，且經濟環保。文獻報道顯示，在室溫條件下，pH 5.5～8.0時，番瀉苷較為穩定，在pH 6.5時，番瀉苷最穩定。因此，本實驗利用0.5%的碳酸氫鈉60℃攪拌提取番瀉苷后，將溶液調回中性，50℃減壓濃縮，冰凍干燥成固體，有利于番瀉苷的保存。

溫度是影響番瀉苷A和番瀉苷B穩定性的主要因素，在高溫受熱過程中，特別是在高濃度乙醇作為溶劑的條件下，番瀉苷A和番瀉苷B易發生降解，且番瀉苷B降解速率更大，番瀉苷A和番瀉苷B 60℃時在水中比較穩定，所以損失率較小［19］，文獻也多有提到番瀉苷類成分不穩定［20］。因此本實驗選取60℃作為提取的最高溫度。隨著中藥的現代化發展，各種番瀉葉制劑或者含其活性成分番瀉苷的制劑越來越多［21］。在制劑制備過程中，提取、分離、濃縮、干燥等步驟均應注意穩定性問題。

本實驗優選最佳提取工藝后，進行了3批放大提取，番瀉苷A和番瀉苷B的總提取率均達到預期，提取工藝穩定可靠，可為番瀉苷相關研究和實際生產提供依據。

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The orthogonal experiment method to optimize the extraction process of senna

JIN Shi-shi1，NIU Huan-yun1，DING Hui1，WU Jie1，YU He-shui1，LI Wei1，CAO Man2，SONG Xin-bo1，2
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin Zhongyi Pharmaceutical Co.Ltd，Tianjin 300193，China）

［Objective］To select the best extraction process of sennoside from senna.［Methods］To establish the method for simultaneous determination of Sennoside A and Sennoside B，the method utilizes the content of Sennoside A and Sennoside B as a quality control.Based on the single factor，the best extraction process is selected by orthogonal test.［Results］The best process for extraction was 10 fold 0.5%sodium bicarbonate was used to extract Sennoside under 60℃for an hour.［Conclusion］The developed process is stable and reliable，and can be readily utilized for related research and actual production.

senna；sennoside；sennoside A；sennoside B；extraction process

R284.2

A

1673-9043（2016）02-0122-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.02.13

天津市組分中藥創制與分析服務平臺建設（12TX GCCX03800）。

金施施（1989-），女，碩士研究生，主要從事中藥化學成分分離與分析。

宋新波，E-mial：songxinbo@tjutcm.edu.cn。

（2015-11-14）