RP-HPLC法同時測定半夏糖漿中乙酸和琥珀酸的含量Δ

何 丹，楊曉梅，傅 亞，秦少容，張景勍（1.重慶醫科大學藥物高校工程研究中心/重慶醫科大學藥學院，重慶 00016；.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 0111；.重慶科技學院化學化工學院，重慶011；.太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司，重慶 08000）

RP-HPLC法同時測定半夏糖漿中乙酸和琥珀酸的含量Δ

何 丹1＊，楊曉梅2，傅 亞3，秦少容4，張景勍1#（1.重慶醫科大學藥物高校工程研究中心/重慶醫科大學藥學院，重慶 400016；2.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121；3.重慶科技學院化學化工學院，重慶401331；4.太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司，重慶 408000）

目的：建立同時測定半夏糖漿中乙酸和琥珀酸含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為GL InterSustain-C18，流動相為0.03 mol/L磷酸二氫銨緩沖液（pH2.0）-甲醇（梯度洗脫），流速為0.8 ml/min，檢測波長為210 nm，柱溫為30℃，進樣量為10 μl。結果：乙酸和琥珀酸檢測質量濃度線性范圍分別為0.020 98～0.209 8（r=0.999 9）、12.04～120.4 μg/ml（r= 0.999 9）；定量限分別為0.15、18.24 ng，檢測限分別為0.045、5.53 ng；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2%；加樣回收率分別為97.45%～101.68%（RSD=1.39%，n=9）、98.31%～101.08%（RSD=1.01%，n=9）。結論：該方法準確、快速，適用于同時測定半夏糖漿中乙酸和琥珀酸的含量。

反相高效液相色譜法；半夏糖漿；乙酸；琥珀酸

半夏糖漿是由生半夏、紫苑、麻黃、桔梗等9味中藥材組成的復方口服制劑，具有止咳化痰的功效，臨床上常用于治療風寒咳嗽、支氣管炎和咳嗽痰多等癥［1］。本品收載于《衛生部藥品標準中藥成方制劑》第9冊，但尚未被2015年版《中國藥典》收載。現有標準僅采用理化鑒別對半夏糖漿中的甘草酸和橙皮苷進行鑒別［1］，尚無有效成分含量測定項內容。目前，對半夏糖漿有效成分的報道有采用薄層色譜法進行定性鑒別［2］，有采用高效液相色譜法（HPLC）測定半夏糖漿中甘草酸和橙皮苷的含量［3-5］或者測定麻黃堿和鹽酸麻黃堿的含量［6-10］，也有采用氣相色譜法（GC）測定半夏糖漿中薄荷腦含量［11］的報道。半夏為天南星科植物半夏的干燥塊莖，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效［12］，半夏塊莖中主要含有有機酸和多糖類成分［13-14］，其中有機酸有鎮咳祛痰的藥理作用［15］，為半夏糖漿止咳功效的主要有效成分。目前尚未見對半夏糖漿中有機酸——乙酸和琥珀酸進行含量測定的報道，因此本課題組采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）同時測定半夏糖漿中乙酸和琥珀酸的含量，以期為半夏糖漿的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20型HPLC儀（日本Shimadzu公司）；AG135型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

半夏糖漿（李時珍醫藥集團有限公司，批號：201404003、201404001、201401002，規格：100 ml/瓶）；琥珀酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110896-200001，純度≥99.0%）；乙酸對照品（重慶川東化工有限公司，批號：20130801，純度≥99.0%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：GL InterSustain-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.03 mol/L磷酸二氫銨緩沖液（pH2.0）（A）-甲醇（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：0.8 ml/min；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密量取乙酸對照品0.1 ml，精密稱取琥珀酸對照品60.18 mg，置于同一50 ml量瓶中，加水溶解并定容，得乙酸和琥珀酸的混合對照品貯備液；精密量取上述貯備液2.5 ml，置于25 ml量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，得乙酸和琥珀酸質量濃度分別為0.209 8、120.4 μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密吸取樣品1 ml，置于10 ml量瓶中，加水溶解并定容，經0.45 μm混合纖維樹脂膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的制備工藝和處方比例制備缺乙酸和琥珀酸的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，乙酸和琥珀酸均能達到基線分離，分離度＞2，拖尾因子均＜2.0；理論板數按乙酸峰計≥3 000，保留時間為8.9 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.乙酸；2.琥珀酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control；1.acetic acid；2.succinic acid

2.4 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 ml，分別置于10 ml量瓶中，加水溶解并定容，即得系列線性溶液，取上述溶液適量，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得乙酸的回歸方程為y=47 926x－973.96（r=0.999 9）、琥珀酸的回歸方程為y=55.466x－478.5（r= 0.999 9）。結果表明，乙酸和琥珀酸檢測質量濃度線性范圍分別為0.020 98～0.209 8、12.04～120.4 μg/ml。

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得乙酸和琥珀酸的定量限分別為0.15、18.24 ng；當信噪比為3∶1時，得乙酸和琥珀酸的檢測限分別為0.045、5.53 ng。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，乙酸和琥珀酸峰面積的RSD分別為1.29%、0.81%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：201404003）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，乙酸和琥珀酸峰面積的RSD分別為0.95%、1.31%（n=6），表明供試品溶液在室溫下10 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：201404003）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，乙酸和琥珀酸峰面積的RSD分別為0.86%、1.22%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已測知含量的樣品（批號：201404003）適量，共9份，每份0.5 ml，分別置于10 ml量瓶中，分別加入一定質量的乙酸和琥珀酸對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n=9）Tab 2 Results of recovery tests（n=9）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算乙酸和琥珀酸的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（n=3）Tab 3 Results of contents determination of samples（n=3）

3 討論

3.1 流動相pH的選擇

本課題組考察了流動相pH分別為2.8、2.6、2.4、2.2、2.0時對樣品中乙酸和琥珀酸分離情況的影響。結果表明，當流動相pH為2.8時，乙酸和琥珀酸與相鄰組分之間的分離度不夠理想，峰形較差，影響測定的準確度；當調節流動相的pH為2.0時，乙酸和琥珀酸峰形較好，且與相鄰組分能夠得到較好的分離。因此，本試驗選擇流動相的pH為2.0。

3.2 緩沖液種類的選擇

本課題組分別選擇磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀作為流動相中的緩沖液，考察不同緩沖液對乙酸和琥珀酸分離度的影響。結果，當選擇磷酸二氫鉀作為緩沖液時，乙酸和琥珀酸色譜峰均出現拖尾峰，峰形較寬；當選擇磷酸二氫銨作為緩沖液時，乙酸和琥珀酸的峰形較好，分離度較好。因此，選擇磷酸二氫銨為本試驗的緩沖液。

綜上所述，本方法準確、快速，適用于同時測定半夏糖漿中乙酸和琥珀酸的含量。

［1］衛生部藥典委員會.衛生部藥品標準中藥成方制劑：第9冊［S］.北京：人民衛生出版社，1994：186-186.

［2］ 朱山寅.半夏糖漿的薄層鑒別研究［J］.江西中醫學院學報，2002，14（1）：43.

［3］ 張旭君.半夏糖漿含量測定研究［J］.現代醫院，2012，12（2）：69.

［4］陽文武，張德偉，肖琦，等.半夏止咳糖漿質量標準研究［J］.中國民族民間醫藥，2013，10（30）：14.

［5］肖光清，黃文平，黃琴，等.半夏止咳糖漿質量標準研究［J］.江西中醫藥，2014，45（9）：61.

［6］周銳，王輝.半夏糖漿質量標準的研究［J］.時珍國醫國藥，2010，21（6）：1 542.

［7］鐘名誠，黃海燕，季永平.半夏糖漿質量標準研究［J］.中國藥業，2008，17（10）：28.

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［9］ 陳紀海，林琳，阮治綱.HPLC法測定半夏糖漿中麻黃堿的含量［J］.現代中藥研究與實踐，2010，15（1）：59.

［10］付靜，朱月月，聶詩明.高效液相色譜法測定半夏糖漿中麻黃堿和偽麻黃堿含量［J］.中國藥業，2015，24（22）：114.

［11］李楠，楊燕飛.氣相色譜法測定半夏糖漿中薄荷腦含量［J］.中國藥業，2010，19（18）：49.

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［13］張之昊，戴忠，胡曉茹，等.半夏化學成分的分離與鑒定［J］.中藥材，2013，36（10）：1 620.

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Simultaneous Determination ofAceticAcid and SuccinicAcid in Banxia Syrup by RP-HPLC

HE Dan1，YANG Xiaomei2，FU Ya3，QIN Shaorong4，ZHANG Jingqing1（1.Medicine Engineering Research Center of Chongqing Medical University/College of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China；3.College of Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University of Science and Technology，Chongqing 401331，China；4.Taiji Chongqing Fuling Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Chongqing 408000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of acetic acid and succinic acid in Banxia syrup.METHODS：RP-HPLC was performed on the column of GL InterSustain-C18with mobile phase of 0.03 mol/L ammonium dihydrogen phosphate buffer solution（pH2.0）-methanol（gradient elution）at a flow rate of 0.8 ml/min，the detection wavelength was 210 nm，column temperature was 30℃，injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 0.020 98-0.209 8 μg/ml for acetic acid（0.999 9）and 12.04-120.4 μg/ml for succinic acid（r=0.999 9）；limits of quantification were 0.15，18.24 ng，limits of detection were 0.045，5.53 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 97.45%-101.68%（RSD=1.39%，n=9）and 98.31%-101.08%（RSD=1.01%，n=9）.CONCLUSIONS：The method is accurate and rapid，and suitable for the simultaneous determination of acetic acid and succinic acid in Banxia syrup.

RP-HPLC；Banxia syrup；Acetic acid；Auccinic acid

R917

A

1001-0408（2016）30-4264-03

2015-11-01

2016-07-16）

（編輯：劉 柳）

重慶市教委科學技術研究項目（No.KJ1500225）

＊副教授，碩士。研究方向：藥物分析。電話：023-68589782。E-mail：ildoctor@163.com

#通信作者：教授，博士生導師。研究方向：藥物新劑型。E-mail：zjqrae01@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.28