HPLC法同時(shí)測定參芪扶正注射液中6種成分的含量

舒 娟，楊勝斌（1.銅仁市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州銅仁 554300；.銅仁市人民醫(yī)院，貴州銅仁 554300）

HPLC法同時(shí)測定參芪扶正注射液中6種成分的含量

舒 娟1＊，楊勝斌2（1.銅仁市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州銅仁 554300；2.銅仁市人民醫(yī)院，貴州銅仁 554300）

目的：建立同時(shí)測定參芪扶正注射液中黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Ultimate XB-C18，檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器，流動(dòng)相為乙腈-0.5%甲酸（梯度洗脫），流速為1.2 ml/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、黨參炔苷和芒柄花素檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.62～5.67 μg（r=0.999 6）、0.78～6.31 μg（r=0.999 6）、0.36～3.48 μg（r=0.999 7）、0.81～6.72 μg（r=0.999 5）、0.82～7.03 μg（r=0.999 8）、0.58～6.62 μg（r= 0.999 7）；定量限分別為1.21、0.15、0.12、0.03、0.12、0.17 μg/ml；檢測限分別為0.35、0.35、0.04、0.01、0.03、0.04 μg/ml；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；加樣回收率分別為95.1%～101.1%（RSD=2.0%，n=9）、95.2%～100.7%（RSD=1.9%，n=9）、95.8%～100.2%（RSD=1.4%，n=9）、96.2%～100.6%（RSD=1.7%，n=9）、96.6%～101.2%（RSD=1.4%，n=9）、95.9%～99.5%（RSD=1.2%，n=9）。結(jié)論：該方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于同時(shí)測定參芪扶正注射液中黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、黨參炔苷和芒柄花素的含量。

參芪扶正注射液；高效液相色譜法；黃芪皂苷Ⅰ；黃芪皂苷Ⅱ；黃芪皂苷Ⅲ；黃芪皂苷Ⅳ；黨參炔苷；芒柄花素

參芪扶正注射液主要由黨參和黃芪兩味中藥材組成，具有益氣扶正的功效，主要用于提高氣虛患者的免疫力，改善其氣虛癥狀和生存質(zhì)量［1-3］。方中黃芪主要成分包括皂苷、氨基酸類、多糖以及黃酮等成分，其中黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和芒柄花素是該藥材的主要活性成分，具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，在抗氧化、抗腫瘤和抗疲勞等方面亦具有較好的藥理作用［4-5］。黨參炔苷則是黨參的主要活性成分，其在提高免疫方面均具有較好的療效［6-7］。目前，尚未有對黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素這6種主要活性成分進(jìn)行同時(shí)測定的報(bào)道［7-10］。因此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）建立了同時(shí)測定參芪扶正注射液中黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素含量的方法，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1220型HPLC儀，自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、四元泵、LE-780型ELSD（美國Agilent公司）；EO243S型萬分之一電子天平（德國Eppendorf公司）；SQ-4200型超聲波清洗器（上海精密儀器儀表有限公司，功率：250 W，頻率：50 kHz）。

1.2 藥品與試劑

參芪扶正注射液（麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：2014050179、2014060132、2014070121、2014080131、2014090133，規(guī)格：250 ml/瓶）；黃芪皂苷Ⅰ對照品（批號(hào)：98087110）、黃芪皂苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)：98086745）、黃芪皂苷Ⅲ對照品（批號(hào)：98082873）和黃芪皂苷Ⅳ對照品（批號(hào)：98086721）均購自美國Sigma公司，純度均≥98%；黨參炔苷對照品（批號(hào)：111712-201401）、芒柄花素（批號(hào)：111712-201412）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均＞98%；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測器：ELSD；流動(dòng)相：乙腈-0.5%甲酸，梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.2 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素對照品適量，精密稱定，置于同一25 ml量瓶中，加甲醇制成1 ml含黃芪皂苷Ⅰ1.12 mg、黃芪皂苷Ⅱ1.24 mg、黃芪皂苷Ⅲ0.78 mg、黃芪皂苷Ⅳ1.82 mg、黨參炔苷2.18 mg、芒柄花素1.23 mg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品20 ml，減壓蒸餾后得到浸膏并制備凍干粉末，備用。取上述凍干粉末0.1 g，精密稱定，置于50 ml量瓶中，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，放冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的制備工藝和配方比例分別制備缺黃芩和缺黨參的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法分別制備陰性對照溶液（A和B），即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液（A和B）各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以黃芪皂苷Ⅱ峰計(jì)為2 000，保留時(shí)間為25.5 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.陰性對照A；D.陰性對照B；1.黨參炔苷；2.黃芪皂苷Ⅳ；3.黃芪皂苷Ⅲ；4.芒柄花素；5.黃芪皂苷Ⅱ；6.黃芪皂苷ⅠFig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control A；D. negative control B；1.lobetyolin；2.astragalosideⅣ；3.astragalosideⅢ；4. formononetin；5.astragalosideⅡ；6.astragalosideⅠ

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml，分別置于5 ml量瓶中，加甲醇定容，超聲處理5 min，即得系列線性溶液；取上述溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測限（LOD），結(jié)果見表3。

表3 定量限與檢測限測定結(jié)果Tab 3 Determination results of quantitation limit and detection limit

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素峰面積的RSD分別為1.2%、1.0%、1.3%、0.7%、0.8%、1.2%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素峰面積的RSD分別為1.3%、1.2%、1.3%、0.9%、1.1%、1.6%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：2014050179）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算各成分含量。結(jié)果，黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素的平均含量分別為0.082 0、0.007 9、0.017 1、0.049 0、0.003 9、0.052 8 mg/g，RSD分別為1.2%、1.1%、1.9%、1.7%、1.8%、1.8%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：2014050179）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備凍干粉末，稱取9份，每份約2 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，分別加入低、中、高質(zhì)量的黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

2.10 樣品含量測定

取“1.2”項(xiàng)下5批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素的含量，結(jié)果見表5。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab 4 Results of recovery tests（n=9）

表5 樣品含量測定結(jié)果（n=3，mg/g）Tab 5 Results of contents determination of samples（n=3，mg/g）

3 討論

筆者分別考察了甲醇-水、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.5%甲酸作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相對待測成分分離度的影響。結(jié)果，采用甲醇-水、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，各成分的分離度不好、均有拖尾現(xiàn)象，而采用乙腈-0.5%甲酸作為流動(dòng)相時(shí)各成分分離效果均較好，因此選擇乙腈-0.5%甲酸為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

綜上所述，本方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于同時(shí)測定參芪扶正注射液中黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、黨參炔苷和芒柄花素的含量。

［1］Cai YM，Zhang Y，Zhang PB，et al.Neuroprotective effect of Shenqi Fuzheng injection pretreatment in aged rats with cerebral ischemia/reperfusion injury［J］.Neural Regen Res，2016，11（1）：94.

［2］Li J，Wang JC，Ma B，et al.Shenqi Fuzheng injection for advanced gastric cancer：a systematic review of randomized controlled trials［J］.Chin J Integr Med，2015，21（1）：71.

［3］古洪艷，張聲源，黃文華，等.參芪扶正注射液的化學(xué)成分研究：Ⅱ［J］.中成藥，2013，35（7）：1 494.

［4］馮佩佩，李忠祥，原忠.黨參屬藥用植物化學(xué)成分和藥理研究進(jìn)展［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，29（4）：307.

［5］周超，何軼，林瑞超，等.黃芪4種皂苷提取物的制備及其在黃芪總皂苷含量測定中的應(yīng)用［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（22）：56.

［6］吳忠民，賈忠，李喜香，等.黃芪黨參顆粒中黃芪甲苷含量的HPLC測定方法［J］.西部中醫(yī)藥，2012，25（10）：23.

［7］梁瑾，劉小花，任遠(yuǎn)，等.HPLC-DAD-ELSD法同時(shí)測定黃芪中5個(gè)成分的含量［J］.藥物分析雜志，2013，33（2）：210.

［8］ Luisa P，Alessandra B，Elena L.Antimicrobial and antifungal activity of crude extracts and isolated saponins fromAstagalus errucosus［J］.Fitoterapia，2002，73：336.

［9］Krasteva IN，Toshkova RA，Nikolov SD.Protective effect of Astragalus corniculatus saponins against myeloid graffi tumour in hamsters［J］.Phytother Res，2004，18（3）：255.

［10］梁麗娟，趙奎君，屠鵬飛，等.HPLC法同時(shí)測定黃芪中4種黃酮類成分的含量［J］.中國藥房，2010，21（15）：1 385.

（編輯：劉 柳）

Simultaneous Determination of Six Components in Shenqi Fuzheng Injection by HPLC

SHU Juan1，YANG Shengbin2（1.Tongren Institute for Food and Drug Control，Guizhou Tongren 554300；2.Tongren People’s Hospital，Guizhou Tongren 554300，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the contents determination of astragalosidesⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，lobetyolin and formononetin in Shenqi fuzheng injection.METHODS：HPLC was performed.The detector was evaporative light scattering detector，column was Ultimate XB-C18with mobile phase of acetonitrile-0.5%formic acid（gradient elution）at a flow rate of 1.2 ml/min，column temperature was 30℃，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 0.62-5.67 μg for astragalosidesⅠ（r=0.999 6），0.78-6.31 μg for astragalosidesⅡ（r=0.999 6），0.36-3.48 μg for astragalosidesⅢ（r=0.999 7），0.81-6.72 μg for astragalosidesⅣ（r=0.999 5），0.82-7.03 μg for lobetyolin（r=0.999 8）and 0.58-6.62 μg（r=0.999 7）formononetin；limit of quantitation was 1.21，0.15，0.12，0.03，0.12，0.17 μg/ml；limit of detection was 0.35，0.35，0.04，0.01，0.03，0.04 μg/ml；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 95.1%-101.1%（RSD=2.0%，n=9），95.2%-100.7%（RSD=1.9%，n=9），95.8%-100.2%（RSD=1.4%，n=9），96.2%-100.6%（RSD=1.7%，n=9），96.6%-101.2%（RSD=1.4%，n=9）and 95.9%-99.5%（RSD=1.2%，n=9），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate，and can be used for the simultaneous determination of astragalosidesⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，lobetyolin and formononetin in Shenqi fuzheng injection.

Shenqi fuzheng injection；HPLC；AstragalosideⅠ；AstragalosideⅡ；AstragalosideⅢ；AstragalosideⅣ；Lobetyolin；Formononetin

R917

A

1001-0408（2016）30-4275-03

2016-05-18

2016-08-07）

＊主管中藥師。研究方向：中藥及中成藥的檢驗(yàn)方法及質(zhì)量控制。E-mail：563965969@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.32