低分子肝素相對分子質(zhì)量與抗凝活性關(guān)系研究

貝宇飛，彭安林，殷曉芹，周海云，肖威章，丁翔

1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南通　226001；2.武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢　430070；3.南通大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南通　226001；4.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，浙江杭州　310009；5.南通大學(xué)附屬醫(yī)院心血管外科，江蘇南通　226001；6.解放軍161醫(yī)院心內(nèi)科，湖北武漢　430000

低分子肝素相對分子質(zhì)量與抗凝活性關(guān)系研究

貝宇飛1，彭安林2，殷曉芹3，周海云4，肖威章5，丁翔6

1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南通226001；2.武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢430070；3.南通大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇南通226001；4.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，浙江杭州310009；5.南通大學(xué)附屬醫(yī)院心血管外科，江蘇南通226001；6.解放軍161醫(yī)院心內(nèi)科，湖北武漢430000

目的 分析低分子肝素相對分子質(zhì)量與抗凝活性關(guān)系，為新藥研發(fā)、藥品質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法 采用HPSEC-MALLS-RI聯(lián)用法測定3種對照品、6中國國內(nèi)生產(chǎn)低分子肝素，1號 （國藥準(zhǔn)字H19990078，生產(chǎn)批號20160105）、2號（國藥準(zhǔn)字H20010300，尤尼舒，國藥準(zhǔn)字H20010300，生產(chǎn)批號20150914）、3號（立邁青，國藥準(zhǔn)字 H10980166，生產(chǎn)批號 160204）、4號（賽博利，國藥準(zhǔn)字 H20060190，生產(chǎn)批號 160114）、5號（國藥準(zhǔn)字H20063909，生產(chǎn)批號151019）、6號（國藥準(zhǔn)字H20020470，博璞青，生產(chǎn)批號151214），測定相對分子量，采用生色底物法進(jìn)行測定抗凝活性指標(biāo)。結(jié)果1號、2號、3號、4號、5號、6號，相對分子量分別為4 987、6 943、5 767、5 742、16851、16172，抗Ⅱa因子效價分別為3942IU/mL、3 091 IU/mL、3 786 IU/mL、3 184 IU/mL、5 916 IU/mL、5 542 IU/mL，Xa因子/Ⅱa因子效價比與相對分子量無顯著相關(guān)性。結(jié)論 低分子肝素相對分子質(zhì)量與抗凝活性有關(guān)，但并非決定性因素，在原料、制劑狀態(tài)下，影響機(jī)制存在差異。

低分子肝素；相對分子質(zhì)量；抗凝活性

低分子肝素是新一代肝素抗凝藥物，相較于普通肝素，抗凝活性更好，并發(fā)癥發(fā)生率更低［1］。中國低分子肝素主要分為鈉鹽、鈣鹽兩類，國內(nèi)越來越多的企業(yè)開始研發(fā)申報低分子肝素。但中國藥典尚未收載低分子肝素，且沒有分類標(biāo)準(zhǔn)，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)較混亂［2-3］。低分子肝素是防治血栓性疾病的常用藥物，具有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＴ摯窝芯吭嚪治龅头肿痈嗡叵鄬Ψ肿淤|(zhì)量與抗凝活性關(guān)系，為新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：酶標(biāo)儀、pH計、電子天平、Milli-Q超純水裝置、96孔板、移液槍、中國藥典生物檢定系統(tǒng)程序BS2000，LC-20AD高效液相色譜儀，激光光散射檢測儀，Wyatt示差檢測器。試劑：醋酸銨，國產(chǎn)分析純，歐洲藥典低分子肝素分子量測定對照品ERCRS，美國藥典依諾肝素鈉對照品，WHO第二次國際協(xié)作標(biāo)定對照照片，抗Xa因子效價1097IC/支、抗Ⅱa因子效價 326 IU/支，三羥甲基氨基氨基甲烷、聚乙二醇6000、氯化鈉、抗凝血酶、凝血酶、發(fā)色底物S2765、S226，去離子水（去電阻率≥18.2MΩ·cm）。1號（國藥準(zhǔn)字H19990078，生產(chǎn)批號20160105）、2號（國藥準(zhǔn)字H20010300，尤尼舒，國藥準(zhǔn)字H20010300，生產(chǎn)批號20150914）、3號（立邁青，國藥準(zhǔn)字H10980166，生產(chǎn)批號160204）、4號（國藥準(zhǔn)字H20060190，生產(chǎn)批號160114）、5號（國藥準(zhǔn)字H20063909，生產(chǎn)批號151019）、6號（國藥準(zhǔn)字H20020470，博璞青，生產(chǎn)批號151214）低分子肝素鈣

1.2方法

1.2.1相對分子量測定色譜條件：美Astra 5.3.4.10軟件，TSK G2000SWxl（7.8×300），0.1M醋酸銨溶液移動相，0.5 mL/min流速，激光光散射檢測儀，Wyatt示差檢測器，柱溫0.5 mL/min，進(jìn)樣體積200 μL，柱壓力24 kgf/cm2，采集時間35 min。對照品、供試品溶液采用EP－HPSEC法配置，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾，進(jìn)樣錢經(jīng)沖洗檢測器檢測。dn/dc測定：測定一次制備的4批備選材料的dn/dc值，150℃烘干樣品，依次配置為7個梯度濃度的供試品溶液，以水、梯度濃度供試品溶液、水依次注入示差檢測器，據(jù)平臺期控制注入時間。測的值為0.130，取系統(tǒng)歸一化樣本3.1萬右旋糖體，流動相配置5 mg/mL溶液，進(jìn)樣50 μL。分別取3類標(biāo)準(zhǔn)對照品適量，加流動相溶解10 mL/mL對照品，0.2 μm濾膜過濾，進(jìn)樣，檢測相對分子量，進(jìn)行重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗。

1.2.2抗凝活性檢測配置Tris緩沖液、50%醋酸溶液、抗凝血酶（ATⅢ）溶液、FXa溶液、凝血酶溶液、發(fā)色底物溶液、標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液。供試品分配來自于6個廠家一批樣品10 mg，以Tris溶液稀釋為10 mg/mL溶液，各配置1個濃度供試品溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2順序向96孔加入空白、供試品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液25 μL與抗凝酶溶液25 μL，混勻，37℃平衡，2 min后加入FXa溶液50 μL，混勻，37℃，2 min，加入發(fā)色底物溶液50 μL，混勻，37℃保溫，2 min，加50%醋酸溶液。酶標(biāo)儀在405 mm波長處測定吸光度。參照《中國藥典》2010年版本第二部中附錄XIV中量反應(yīng)平行線原理實(shí)驗設(shè)計，計算效價。

2　結(jié)果

6種低分子肝素原料，Xa因子/Ⅱa因子效價比隨著相對分子量增大而下降。見表1。

表1　國內(nèi)6種低分子肝素原料相對分子量、抗凝活性實(shí)測對比

制劑實(shí)測結(jié)果顯示，低分子肝素相對分子量與Xa因子效價、Ⅱa效價、Xa因子/Ⅱa因子效價比值無線性相關(guān)性，但低分子肝素抗Ⅱa因子效價總體隨著相對分子量的增大而增大，而其Xa因子/Ⅱa因子效價比與相對分子量無顯著相關(guān)性。見表2。

表2　國內(nèi)6種低分子肝素制劑相對分子量、抗凝活性實(shí)測對比

3　討論

低分子肝素是由普通肝素經(jīng)物理化、化學(xué)或酶解聚方法而得到的一種物質(zhì)，分子量在3 000～8 000，相較于普通肝素抗血栓活性更好，且出現(xiàn)副作用少［4］。低分子肝素基本結(jié)構(gòu)是由二糖重復(fù)單元通過1，4-糖苷鍵連接構(gòu)成的線性硫酸化多糖。其結(jié)構(gòu)形式較復(fù)雜，分子量呈現(xiàn)分散性，硫酸根、羧酸根高負(fù)電荷性，使其結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，至今為止，低分子肝素的結(jié)構(gòu)仍為被完全闡明［5］。低分子肝素結(jié)構(gòu)多樣性賦予了其獨(dú)特的生物活性多樣性。在臨床上其活性研究主要集中在抗栓活性、抗凝活性，其抗栓活性研究較深入，抗栓活性主要依賴于戊糖活性中心。

國內(nèi)廠家低分子肝素原料、制劑抗凝活性均在達(dá)標(biāo)范圍內(nèi)，總體上看相對分子量直接影響抗凝活性，至少需要18個糖單元長度才能使低分子肝素與ATⅢ、Ⅱa形成三元復(fù)合物發(fā)揮抗凝效果［6］。但分子量并非絕定性因素，干擾因素較多，藥物的狀態(tài)直接影響抗凝活性，質(zhì)量不穩(wěn)定，也可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)［7］。低分子肝素呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)多樣性特征，抗凝活性不僅與分子量有關(guān)，還與戊糖活性中心有關(guān)。從本次研究來看，低分子肝素抗凝活性抗Ⅱa因子效價總體隨著相對分子量的增大而增大，1號、2號、3號、4號、5號、6號，低分子肝素制劑相關(guān)分子量分別為4 987、6 943、5 767、5 742、16 851、16 172，分子量在5 000～17 000之間，也是現(xiàn)在國內(nèi)外生產(chǎn)的低分子肝素鈣主要分子量。受檢測儀器精度、方法、產(chǎn)品質(zhì)量的因素影響，不同學(xué)者檢測同一廠家生產(chǎn)的同類產(chǎn)品分子量可能存在一定的差異。1-6號抗Ⅱa因子效價分別為3 942 IU/mL、3 091 IU/mL、3 786 IU/mL、3 184 IU/mL、5 916 IU/mL、5 542 IU/mL，Xa因子/Ⅱa因子效價比隨著相對分子量增大而下降，但不呈現(xiàn)線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)不穩(wěn)定，干擾因素較多，也證實(shí)了分子量并非決定抗凝活性的唯一因素。國際標(biāo)準(zhǔn)品批號抗Xa影子的效價為1 097 ICU/支持，抗Ⅱa因子效價為320～330 IU/支，這些產(chǎn)品均達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)品的效價要求，也達(dá)到了國內(nèi)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)抗Xa因子效價＞70 IU/mg的標(biāo)準(zhǔn)。需注意的是這些產(chǎn)品實(shí)測的抗Xa因子活性能力與標(biāo)注的產(chǎn)品存在一定的差異。

近年來，對進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾低分子肝素生產(chǎn)的普遍做法，通過改進(jìn)工藝流程，影響戊糖序列的硫酸化程度，進(jìn)而影響抗凝活性的發(fā)揮［7］。如通過利用2-位O-磺酸基轉(zhuǎn)移酶對IdoA的C2-位羥基進(jìn)行硫酸化，可明顯提高抗凝活性，增加3～5倍［8］。此外，通過改變ATⅢ結(jié)合的特異性戊糖序列含量也可影響抗凝活性大小。故目前開始采用高效陰離子交換，電導(dǎo)檢測低分子肝素游離硫酸根系統(tǒng)等間接測量方法，評價低分子肝素質(zhì)量。

綜上所述，低分子肝素相對分子質(zhì)量與抗凝活性有關(guān)，但并非決定性因素，相關(guān)系數(shù)較低；今后有必要開展結(jié)構(gòu)修飾、超低分子量肝素研究，進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾、分子量之間、抗凝活性的相關(guān)性分析，以指導(dǎo)新型低分子肝素的研發(fā)。

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The Study on the Relationship Between the Relative Molecular Mass and the Anticoagulant Activity of Low Molecular Weight Heparin

BEI Yu-fei1，PENG An-lin2，YIN Xiao-qin3，ZHOU Hai-yun4，XIAO Wei-zhang5，DING Xiang6
1.Department of Pharmacy，Hospital Affiliated to Nantong University，Nantong，Jiangsu Province，226001 China；2.Third Department of Pharmacy，the Third Hospital of Wuhan，Wuhan，Hubei Province，430070 China；3.Department of Pharmacy，Hospital Affiliated to Nantong University，Nantong，Jiangsu Province，226001 China；4.Second Department of Pharmacy，the 4 Affiliated Hospital，Zhejiang University Medical College，Hangzhou，zhejiang Province，310009 China；5.Department of Cardiovascular Surgery，Hospital Affiliated to Nantong University，Nantong，Jiangsu Province，226001 China；6.Department of Cardiology，the 161 Hospital of PLA，Wuhan，Hubei Province，430000 China

Objective Low molecular weight heparin relative molecular mass and anticoagulant activity relationship analysis，for the development of new drugs，the drug quality control provide the basis.Methods By HPSEC-MALLS-RI spectrometry for the determination of three kinds of control，6 Chinese domestic production of low molecular weight heparin（LMWH），No.1（Chinese medicine quasi word H19990078，production batch number 20160105），No.2（thecountry medicine accurate word H20010300，uni Shu and Chinese medicine quasi word H20010300，production batch number 20150914）and No.3（Livaracine and Chinese medicine quasi word H10980166，production batch number 160204）No.4（match Boley，Chinese medicine quasi word H20060190，production batch number 160114），No.5（the country medicine accurate word H20063909，production batch number 151019），6（the country medicine accurate word H20020470，Bo Pu Qing，production batch number 151214），Determination of relative molecular weight，anticoagulant activity index were measured by chromogenic substrate method.Results No.1，No.2，No.3，No.4，No.5，No.6，relative molecular weight respectively 4 987、6 943、5 767、5 742、16 851、16 172，anti II a factor titers respectively for 3 942 IU/mL，3 091 IU/mL，3 786 IU/mL，3 184 IU/mL，5 916 IU/mL，5 542 IU/mL，factor Xa/II a factor potency ratio were not significantly correlated with the relative molecular weight.Conclusion the relative molecular weight of low molecular weight heparin was related to the anticoagulant activity，but not the decisive factor.

Low molecular weight heparin；Relative molecular mass；Anticoagulant activity

R973.2

A

2096-1782（2016）10－0108-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.10.108

貝宇飛（1980.10-），男，湖北武漢人，碩士，主管藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)及生藥學(xué)。

（2016-07-15）