豬肺炎支原體高密度發酵工藝的研究

朱秀同 高曉磊 張德寶 柳 珊 郁宏偉 李曉艷 劉 濤

豬肺炎支原體高密度發酵工藝的研究

朱秀同 高曉磊 張德寶 柳 珊 郁宏偉 李曉艷 劉 濤

（瑞普（保定）生物藥業有限公司，河北保定 071000）

為提高豬肺炎支原體發酵培養的滴度，在500L發酵罐基礎上，對豬肺炎支原體J株的發酵工藝進行了一系列優化試驗，各項發酵培養條件經優化后，發酵支原體的滴度得到了明顯提高，發酵滴度可達到1×109CCU/ml以上，本研究為提供高效、安全和穩定的豬肺炎支原體疫苗產品奠定基礎。

豬肺炎支原體；發酵工藝；優化

豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是引起豬支氣管肺炎（Mycoplasmal pneumoniae of swine，俗稱豬氣喘?。┑闹饕≡?。該病廣泛存在于世界各國，嚴重危害著養豬事業的發展。豬只感染后除導致飼料轉化率降低生長發育不良外，且易繼發病毒或細菌感染，造成豬死亡率升高，導致經濟損失慘重［1］，疫苗免疫是預防本病最重要的手段。

肺炎支原體的培養條件非?？量?，是疫苗規?；a的工藝難題。影響豬肺炎支原體發酵的因素非常多，如支原體生長所需的營養物質、接種密度、培養時間、培養基的pH值攪拌轉速以及通氣量等等。我們選用免疫原性良好的J株進行了發酵工藝研究，測定了其在不同培養時期的菌液滴度，明確了該菌株在適宜培養基中的生長趨勢變化；并對各影響參數進行優化以有效提高疫苗的生產效率。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種 豬肺炎支原體J株

1.1.2培養基 據A26培養基配方成分，經瑞普（保定）生物藥業有限公司研發部改進

1.1.3主要設備500L發酵罐

1.2方法

豬肺炎支原體J株培養條件的優化設計按照單個變量順次進行，共進行了以下幾個參數的優化，根據發酵結束時支原體滴度的變色單位（Colour Change Unit，CCU）結果判定優化效果。

1.2.1培養時間的優化 在500L發酵罐中進行，培養基體積為300L，培養基初始pH值調為7.5，將生長穩定的二級種子液按照10%接種，37℃培養，轉速設定為100r/min，培養32h、40h、48h、56h各取樣1次，分別進行CCU測定。

1.2.2局種密度的優化 在500L發酵罐中進行，培養基體積為300L，培養基初始pH值調為7.5，將生長穩定的二級種子液按照1%，5%，10%和15%接種量接種到發酵罐中，37℃培養，轉速設定為100r/min，培養40h取樣，分別進行CCU測定。

1.2.3pH值的優化 按照5%接種量在500L發酵罐中進行，培養基體積為300L，培養基初始pH值調為7.0、7.5、7.8和8.0，37℃培養，37℃培養，轉速設定為100r/min，培養40h取樣，分別進行CCU測定。

1.2.4轉速的優化 按照5%接種量在500L發酵罐中進行，培養基體積為300L，培養基初始pH值調為7.5，轉速分別設定為50r/ min、100r/min、200r/min，37℃培養，培養40h取樣，分別進行CCU測定。

1.2.5通氣量的優化 按照5%接種量在500L發酵罐中進行，培養基體積為300L，培養基初始pH值調為7.5，轉速設定為100r/ min，37℃培養。通氣方式分3種，分別為發酵前一次性補加、100L/min固定不變和200L/min固定不變，各培養40h取樣，分別進行CCU測定。

2 結果與分析

2.1培養時間的優化

不同培養時間的支原體計數結果顯示，40h為最佳培養時間，過早或過晚停止發酵培養物滴度均偏低（見表1），發酵后40h可能豬肺炎支原體正處于對數生長期，尚未進入衰退期，所以滴度相對較高。

表1　培養時間對豬肺炎支原體生長的影響

2.2接種密度的優化

本研究結果顯示，接種密度對豬肺炎支原體產生較大影響，5%-10%的接種量比較適宜（表2）。過低的接種密度會導致支原體生長過慢，過高則會使營養物質早期大量消耗，致使支原體生長提前進入衰亡期。

表2　接種密度對豬肺炎支原體生長的影響

2.3pH值的優化

本研究結果顯示，發酵前培養基的pH值對豬肺炎支原體發酵有重要影響，pH值在7.5～7.8范圍內所得菌數較高，為最適pH值范圍（見表3）。pH值過低或過高均達不到良好的效果。

表3　pH值對豬肺炎支原體生長的影響

2.4轉速的優化

本研究結果顯示，不同攪拌轉速對豬肺炎支原體發酵有重要影響，100rpm為最適宜轉速，過低生長速度較慢，過高則導致菌體大量死亡（見表4）。

表4　轉速對豬肺炎支原體生長的影響

2.5通氣量的優化

本研究結果顯示，通氣量的改變對豬肺炎支原體生長無明顯影響（見表5）。

表5　通氣量對豬肺炎支原體生長的影響

3 討論與小結

針對不同菌種和不同用途的發酵都需要對影響發酵的各項參數進行綜合考慮，只有對發酵條件進行全面優化才能達到預期的效果。發酵罐體積不同，發酵時各項參數對豬肺炎支原體培養滴度的影響也不同，不能照搬其它發酵研究的結果。本研究對豬肺炎支原體J株的培養時間、接種密度、pH值、轉速和通氣量等5項發酵參數進行了優化試驗，基本確定了在500L發酵罐上的發酵培養方式，即發酵時選擇加入5%的二級種子液、調節培養基pH值7.5～7.8、轉速100rpm，發酵前補入足量滅菌空氣，發酵40h后即可收獲，本研究為為提升發酵培養效率和過程控制提供了重要依據。

值得指出的是，由于豬肺炎支原體培養極為困難，人們通常認為10%的接種量為最佳接種量，本研究結果證明5%的接種量即可保證發酵的成功，過高的接種密度不僅會造成種子的浪費，而且會使營養物質在培養早期便大量消耗，致使細菌生長提前進入衰退期。

本研究中用到的滴度測定方法為CCU法，該方法是以微生物在培養基中的代謝活力為指標來計算微生物的含量的，研究中，我們采用該法對培養菌液進行2次重復計數，取平均值為最終結果。與PCR等快速判斷的方法相比，CCU法雖然具有耗時長的缺點（10d），但其數據可靠，操作簡便，可重復性強，重要的是CCU法反映的是活菌滴度，因此是大生產中最可靠的計數方法，本研究為瑞普生物生產高效、安全和穩定的豬肺炎支原體滅活疫苗產品奠定了基礎。

［1］ RF Ross Mycoplasma Disease. Swine Disease［M］.Iow a State University press，1986：469-483.

朱秀同（1981-），碩士學歷，獸醫師，主要從事獸用生物制品方面研究。

保定市蓮池區科技計劃項目（2016-07）