菜豆中兩種重要檢疫性細(xì)菌檢測方法

楊柳 張 一 王磊

摘要：對菜豆中兩種重要檢疫性細(xì)菌——菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌檢測方法進(jìn)行研究。比較菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌的檢測方法，結(jié)果表明：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法應(yīng)用于菜豆檢疫性細(xì)菌檢測，可實(shí)現(xiàn)快速現(xiàn)場檢測，且特異性強(qiáng)，靈敏度高。對保障國家農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全、保護(hù)我國農(nóng)村菜豆種質(zhì)資源的安全起到重要作用。

關(guān)鍵詞：菜豆萎蔫病菌；菜豆暈疫病菌；檢測；溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

基金項(xiàng)目：吉林工商學(xué)院基金項(xiàng)目（院理科合字〔2015〕第006號）

中圖分類號： S435.24 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.08.058

菜豆又名四季豆、蕓豆、飯豆，為豆科、碟形花亞科、菜豆族、菜豆屬的普通種[1]。

中國是菜豆的主要生產(chǎn)國，也是主要出口國，特別是隨著國家種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，菜豆生產(chǎn)已成為產(chǎn)區(qū)農(nóng)民增收的重要途徑之一[2]。普通細(xì)菌性疫病是影響全世界菜豆生產(chǎn)的主要病害之一，一般可導(dǎo)致20%～60%的產(chǎn)量損失，嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)量損失率高達(dá)80%[3]。本文針對菜豆中菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌兩種檢疫性細(xì)菌的檢測方法進(jìn)行研究，旨在為菜豆種質(zhì)資源的安全起到一定作用。

1 菜豆中兩種重要檢疫性細(xì)菌傳統(tǒng)檢測技術(shù)

目前許多國家針對菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌常用的鑒定檢測方法包括選擇培養(yǎng)基分離檢測法、血清學(xué)測定、免疫熒光菌落染色法、PCR技術(shù)等[3]。

1.1 選擇培養(yǎng)基分離檢測法

趙友福等[4]對菜豆萎蔫病菌的種子檢驗(yàn)鑒定技術(shù)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)523，NBY+ TTC和NBY+剛果紅三種培養(yǎng)基均可作為分離培養(yǎng)基，對帶菌種子分離的靈敏度為1.8×102cuf/m1。

1.2 血清學(xué)測定法

趙友福等[5]對菜豆萎蔫病菌的血清檢測鑒定技術(shù)進(jìn)行了研究，通過對19個(gè)Cff菌株和其他6個(gè)屬14個(gè)種的植物病原細(xì)菌20個(gè)菌株的測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約50%的Cff菌株為強(qiáng)陽性反應(yīng)。血清學(xué)檢測靈敏度為4.5×104 cfu/ml。

1.3 免疫熒光菌落染色法

高泉準(zhǔn)[6] 研究了菜豆萎蔫病免疫熒光菌落染色法快速診斷技術(shù)，靈敏度高達(dá)1.23×107cuf/m1，且可分離出括的菌株。

1.4 PCR檢測法

張曉梅等[7]研究了菜豆萎蔫病菌的PCR檢測技術(shù)，該檢測方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，在100pg的基因組濃度下仍能檢測到很強(qiáng)的條帶。

1.5 傳統(tǒng)檢測技術(shù)的缺點(diǎn)

在上述檢測方法中，選擇培養(yǎng)基分離檢測法檢測周期較好，而且檢測步驟較繁瑣。血清學(xué)檢測技術(shù)雖然效果好，檢測過程易操作，但是檢測目標(biāo)單一。免疫熒光菌落染色法檢測周期長、反應(yīng)靈敏度低。PCR檢測法雖然特異性較強(qiáng)，靈敏度較高，但是測量時(shí)使用的設(shè)備較昂貴，需要專業(yè)人員在實(shí)驗(yàn)室完成，操作過程較繁瑣，不適合于在基層進(jìn)行現(xiàn)場檢測。因此，急需開發(fā)特異性強(qiáng)、檢測靈敏度高、操作簡單、成本低、適用于基層現(xiàn)場快速檢測的方法。

2菜豆中兩種重要檢疫性細(xì)菌LAMP檢測新技術(shù)

2.1 LAMP技術(shù)簡介

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是在65℃恒溫條件下進(jìn)行核酸快速擴(kuò)增，利用兩條特異性內(nèi)引物和兩條特異性外引物識別靶基因上的六個(gè)區(qū)域，其DNA聚合酶具有鏈置換活性，幾十分鐘即可完成核酸擴(kuò)增。

2.2 LAMP技術(shù)用于菜豆中兩種重要檢疫性細(xì)菌檢測的優(yōu)勢

2.2.1 可實(shí)現(xiàn)基層現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測 利用LAMP技術(shù)開發(fā)菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌檢測方法及配套試劑盒，只需對檢測菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌進(jìn)行簡單的DNA提取，就可以完成直接的擴(kuò)增和檢測。檢測過程只需配一臺普通的水浴鍋，就可以在基層進(jìn)行現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測，特別適用于農(nóng)村及偏遠(yuǎn)山區(qū)等進(jìn)行菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌檢測。

2.2.2 檢測靈敏度高 與常規(guī)PCR檢測方法相比，LAMP檢測靈敏度通常是常規(guī)PCR的10～100倍。

2.2.3 檢測速度快 利用LAMP技術(shù)檢測菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌，基本反應(yīng)時(shí)間可以控制在60～90分鐘內(nèi)。如果實(shí)驗(yàn)過程中加入環(huán)引物，反應(yīng)時(shí)間可以縮短到30～45分鐘。

2.2.4 特異性強(qiáng) 利用LAMP方法進(jìn)行菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌檢測，需要在Genebank 上找到菜豆萎蔫病菌、菜豆暈疫病菌的保守序列，采用在線LAMP引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)5組特異引物。與靶序列上的6個(gè)特異性部位進(jìn)行準(zhǔn)確結(jié)合發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR檢測方法相比，特異性更強(qiáng)。

2.2.5 可實(shí)現(xiàn)視化檢測 利用LAMP方法進(jìn)行菜豆萎蔫病菌和菜豆暈疫病菌檢測，在檢測體系中可加入熒光染料——鈣黃綠素，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生綠色熒光，可以通過肉眼直接判斷。

3 結(jié)論

LAMP檢測技術(shù)非常適用于進(jìn)行菜豆中兩種重要檢疫性細(xì)菌的檢測。LAMP技術(shù)的應(yīng)用必將推動基層、農(nóng)村、偏遠(yuǎn)地區(qū)菜豆中重要檢疫性細(xì)菌的檢測向著更低廉、更方便、更準(zhǔn)確的方向發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

[1]馮國軍，徐啟江，李玉花，等.普通菜豆SSR反應(yīng)條件的優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，38（01）：27-34.

[2]馮佰利，魚歡，高小麗，等.中國蕓豆品牌發(fā)展戰(zhàn)略研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（16）：454-457.

[3]徐新新.菜豆普通細(xì)菌性疫病菌原學(xué)研究及抗病種質(zhì)資源鑒定[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012.

[4]趙友福，高泉準(zhǔn)，陳紅燕，等.菜豆萎蔫病菌的種子檢驗(yàn)鑒定技術(shù)研究[J].植物檢疫，1997，11（03）：129-133.

[5]趙友福，陳紅燕，張樂，等.菜豆萎蔫病菌的血清檢測鑒定技術(shù)研究[J].植物檢疫，1997，11（04）：193-198.

[6]高泉準(zhǔn).菜豆萎蔫病免疫熒光菌落染色法快速診斷技術(shù)研究[A].中國植物病理學(xué)會第六屆代表大會暨學(xué)術(shù)年會論文集[C].北京：中國病理學(xué)會.1998：629-631.

[7]張曉梅，林友偉，吳新華，等.菜豆萎蔫病的PCR檢測技術(shù)[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（03）：42-45.