北京地下水中土著反硝化細菌的分離及脫氮性能研究

李麗　王奐玲　王桂芳　周靜

（北京市水文地質工程地質大隊北京100195）

北京地下水中土著反硝化細菌的分離及脫氮性能研究

李麗王奐玲王桂芳周靜

（北京市水文地質工程地質大隊北京100195）

依據本單位對北京市地下水的數年水質監測數據，選取10個硝酸鹽污染的地下水水樣，經溴百里酚藍（BTB）變色培養基初篩及搖瓶培養，成功篩選分離出一株高效反硝化細菌，命名為3-Ⅰ。經16S rRNA基因序列分析，反硝化細菌3-Ⅰ與Rhizobium pusense sp和Beijerinckia fluminensis sp的同源性為99%。3-Ⅰ菌株能夠以乙酸鈉為唯一碳源，以硝酸鹽及亞硝酸鹽為氮源，搖瓶處理72h后在人工配水中硝酸鹽去除率高達99.9%，且無亞硝酸積累；在編號為W 652、HJ121和HJ155的3個北京市地下水水樣中的硝酸鹽去除率均高于99.3%，也無亞硝酸鹽積累，具有一定的工程應用價值。

地下水；硝酸鹽氮污染；反硝化細菌

北京市是為數不多的以地下水作為主要供水水源的國際化大都市，地下水供水量占全市總供水量的2/3[1]。研究指出，目前北京市的地下水資源已經遭受不同程度的硝酸鹽污染，北京市平原農區深層地下水硝態氮污染程度已接近甚至超過歐美國家，淺層地下水污染更為嚴重[8]。長期使用高硝酸鹽含量的飲用水，可導致嬰兒血紅蛋白增高，也可能引起成年人與此相關的癌病發生，威脅人類健康[2-4]。許多國家和機構都規定了地下水中硝酸鹽質量濃度標準，世界衛生組織（WHO）將飲用水中硝酸鹽氮含量的最大允許值限定為11.3mg/L，美國規定其最大允許值為10mg/L，我國規定飲用地下水源的Ⅲ類標準中NO3-N含量不能超過20mg/L。因此，開展北京市地下水硝酸鹽污染修復研究，具有重要的現實意義。

傳統的飲用水處理工藝（絮凝沉淀-過濾-氯氣消毒）對NO3-幾乎無去除效果。目前，地下水硝酸鹽去除方法主要有物理修復、化學修復及生物修復方法。其中，生物反硝化法具有投資小、維護費用低、操作簡便、對環境安全、效率高、降解徹底以及對地理環境要求低等許多優點。脫氮微生物的存在，是生物脫氮作用進行的先決條件，因此，如何從自然環境或人工環境中分離篩選反硝化細菌，增加反硝化細菌的種屬資源，一直是研究的重點。研究表明，國內外已發現并分離篩選出多種好氧反硝化細菌，如糞產堿桿(Alcaligenes faecalis)、異養球硫細菌(Thiosphaera pantotropha)、海洋假單胞菌(Pseudomonas nautical)和細小好氧反硝化菌(Microvirgulaaerodenitrifica)等50多個菌屬[5-8]。反硝化細菌幾乎存在于各種生境中，如果可以從受污染的地下水水體中篩選出一株或幾株土著微生物，可具有較高的生態安全性，并對其進行馴化，強化其除氮效率，鑒定其安全性，在此方向上開展基礎研究，可為今后在該地區開展生物修復技術研究提供基礎資料。

本文從10個受硝酸鹽污染的北京地下水水樣中，成功分離篩選出一株高效反硝化細菌3-Ⅰ，并研究了其在硝酸鹽人工配水和3個受硝酸鹽污染的北京市地下水水樣中的脫氮性能，其硝酸鹽去除率可高達99%。

1材料與方法

1.1材料

培養基有以下幾種：富集培養基：牛肉浸膏5g·L-1，蛋白胨10g·L-1，KNO310g·L-1，pH 7.0，121oC，滅菌20min。反硝化菌基礎培養基：乙酸鈉5g·L-1，K2HPO4·3H2O 1.30g·L-1，KNO31.30g·L-1，FeSO4·7H2O 0.07g·L-1，MgSO4·7H2O 0.1g·L-1，CaCl2·7H2O 0.2g·L-1，pH 7.0，121℃，滅菌20min。

溴百里酚藍培養基（BTB培養基）：乙酸鈉5g·L-1，K2HPO4· 3H2O 1.30g·L-1，KNO31.30g·L-1，FeSO4·7H2O 0.07g·L-1，MgSO4· 7H2O 0.1g·L-1，CaCl2·7H2O 0.2g·L-1，BTB(質量分數為1%的乙醇溶液)1mL，去離子水溶解，用1mol·L-1NaOH溶液調節pH 7.0～7.1，120℃滅菌30m in，培養基呈墨綠色。以上培養基若需固體培養基，加入2%瓊脂即可。

1.2水樣的采集與保存

本實驗共采集地下水樣品10個，詳細信息見表1。水樣于24h內運回實驗室待用。

表1采樣信息

1.3水樣中菌種的分離與篩選

1.3.1水樣中菌種的富集馴化培養

吸取采集的地下水水樣1mL至裝有100m L富集培養基的200mL錐形瓶中，無菌封口膜封口，180r/min，30℃搖床培養，每隔2天取培養物接種至新鮮的富集培養基中，轉接量為10%。連續富集馴化培養6～7次。

1.3.2水樣中菌種的初篩

反硝化過程為堿增加過程，采用含有溴百里酚藍（BTB）指示劑的選擇性培養基進行反硝化菌的初篩[9]。將富集馴化后的菌懸液梯度稀釋涂布于BTB培養基，置于30℃培養，直至出現變藍的菌落或暈圈即確定為初篩的反硝化細菌，然后挑取變藍或有暈圈的菌落重復劃線培養，直至平板菌落無其他形態的菌落為止。

1.3.3水樣中菌種的復篩

將初篩得到的菌株富集培養，吸取50mL菌液離心收集菌體，用反硝化菌基礎培養基懸浮，離心以洗去附著的培養基，再用該培養基10mL懸浮菌體，取一定量測定OD600吸光值,以確定接入菌體的量。再將制備的菌懸液以相同的接菌量接入到100mL含硝酸鹽的基礎液體培養基中，每個菌株設3個重復，設不接菌的基礎培養基為空白，上述操作均在無菌條件下進行。30℃恒溫搖床180r/min振蕩培養72h，將培養基離心過濾后，檢測NO3-和NO2-的含量。

1.4菌株的16S rRNA分子生物學鑒定

16S rRNA序列分析：提取菌株的DNA作為16SrRNA的擴增模板。（1）95℃預變性5m in，（2）95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1m in30s；（3）第2步循環30次；（4）72℃延伸10min，4.0℃保存。得到的PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳純化后進行測序，測序結果在GenBank進行同源性分析。

1.5菌株在水中的硝酸鹽去除性能研究

1.5.1菌株的生長曲線

將菌液以5%的轉接量接入到新鮮的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，置于30℃恒溫搖床180r/min培養，每2h取4mL菌液稀釋后測定OD600值，采用比濁計數法測定該菌不同時間的生長量，根據時間與OD600值的對應關系繪制菌株的生長曲線，明確菌株的生長規律。

1.5.2菌株的最適生長pH值

取過夜培養的新鮮菌液，以5%的接種量分別接種至pH值為5、6、7、8、9和10的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30℃，180r/min搖床培養。分別于接種后的0、2、4、6、8、10、12和14h測其OD600值。

1.5.3菌株在人工配水中的脫氮性能研究

配制與污染地下水中硝酸鹽含量接近的人工配水，組分為：乙酸鈉5 g·L-1，K2HPO4·3H2O 1.30 g·L-1，KNO30.340 g·L-1，FeSO4· 7H2O 0.07g·L-1，MgSO4·7H2O 0.1 g·L-1，CaCl2·7H2O 0.2 g·L-1，pH 7.0。以5%的接種量接種到100mL人工配水中，不加菌的人工配水為空白，30℃180r/min搖床培養。分別于接種后24h、48h和72h測定硝酸鹽含量。

1.5.4菌株在地下水水樣中的脫氮性能研究

取編號為W 652、HJ121、HJ155的污染地下水水樣，加入乙酸鈉5g·L-1，以5%的接種量分別接種到100mL三個原水中，設置加入乙酸鈉的原水為空白，分別于0h和接種后96h測定硝酸鹽含量。

2結果與討論

2.1菌株的初篩

采集的10個地下水水樣經過富集與馴化，將培養液（混合菌群）梯度稀釋涂布于BTB培養基，其中水樣編號為W 911、W912和WR50的培養基變藍，挑取變藍或出現藍色暈圈的菌落劃線純化，從W 911中分離到4株細菌，從W 912中分離到2株，從WR50中同樣分離到2株，共純化得到8株細菌。再將8株細菌劃線培養于BTB培養基，最終得到4株使培養基變藍的菌株，編號為1-Ⅰ、1-Ⅱ、2-Ⅰ和3-Ⅰ。

2.2菌株的復篩

初篩得到的4株菌株72h后的硝酸鹽含量如表2所示，但是1-Ⅰ、1-Ⅱ、2-Ⅰ均產生較多的NO2-積累，不可用于地下水修復。3-Ⅰ菌株的硝酸鹽去除率高達99.7%，且亞硝酸鹽含量也符合國家地下水質量標準Ⅲ類要求[10]。

表2各菌株72h的脫氮性能數據

2.3菌株鑒定結果

將測序得到的序列與Genbank中相關序列比對，結果如表3所示，其與Rhizobium pusense strain NRCPB10和Beijerinckia fluminensisstrain UQM1685的同源性為99%。據文獻報道，根瘤菌屬Rhizobium pusense strain（NRCPB10）是分離自印度新德里種植鷹嘴豆的根際土壤，代表了一種新的根瘤菌屬[11]。孫俊平也曾分離篩選出一株Rhizobium pusense sp在微生物采油和原油污染處理方面具有應用潛力[12]。弗留明拜葉林克氏菌(Beijerinckia fluminensis)可將濾紙條完全崩解，其所在復合菌系對苦參殘渣和稻稈有降解能力[13]。

表3菌株3-Ⅰ16s RNA基因同源性比對結果

3-Ⅰ菌株還需生理生化試驗及其電鏡結果來進一步完成鑒定。據文獻報道[14]，根瘤菌屬具有良好的固氮作用，在氧氣充足的情況下，能夠利用空氣中的氮，但是在氧氣貧乏或溶解氧少的環境下，可以利用NO3-、NO2-作為氮源生長。在本文的實驗過程中，3-Ⅰ菌株能夠在貧氧條件下有效去除水中的硝酸鹽，因此，推測其屬于根瘤菌屬的可能性極大。

2.4菌株的生長曲線和適生長pH值

3-Ⅰ的生長曲線如圖1，在牛肉膏蛋白胨培養基中，該菌在0～2h時處于延遲期，2h后進入對數生長期，6h時對數生長期結束，進入穩定期，下一步實驗可在菌體處于穩定期8h時取樣。

圖1菌株3-Ⅰ生長曲線

圖2菌株3-Ⅰ最適生長pH

由圖2可以看出，3-Ⅰ菌株在牛肉膏蛋白胨培養基中生長時，在pH為7和8的條件下，菌株生長速度較快，且菌株3-ⅠpH變化不敏感，說明該菌株可以適應的酸度范圍較寬，利于今后野外工程使用。為了更接近北京地區地下水的pH，今后實驗選取pH為7時進行。

2.5菌株在人工配水及地下水水樣中的脫氮性能研究

分別于接種24h、48h和96h后測定人工配水中硝酸鹽含量，結果如圖3所示，48h時硝酸鹽含量即由223.9 mg/L降為0.6mg/L，72h時硝酸鹽含量降為0.1mg/L，去除率高達99.9%，且無亞硝酸鹽積累。由于本實驗設計時沒有定量測定乙酸鈉的含量，但從離子色譜圖上看出乙酸根的含量在72h時也消耗完畢。在今后的實驗中，將進一步優化乙酸鈉投入量。

圖3菌株3-Ⅰ降解人工配水中的反硝化特性

分別于0h和接種后96h測定菌株3-Ⅰ處理后的W652、HJ121、HJ155水樣中的硝酸鹽含量，結果如表4所示。通過對這3個水樣進行水質分析，發現其中的離子種類和濃度遠大于人工配水。3-Ⅰ菌株在96h時對地下水中硝酸鹽的去除率均高于99%，可見，3-Ⅰ菌株的脫氮性能基本不受地下水中其它離子的影響。

表4菌株3-Ⅰ分別處理3個地下水水樣的脫氮特性數據

3結語

本文依據本單位數年監測數據選取了10個硝酸鹽污染的地下水水樣，經溴百里酚藍（BTB）變色培養基初篩及搖瓶培養，從中成功分離篩選出1株高效反硝化細菌，命名為3-Ⅰ。經16S rRNA基因序列分析，其與Rhizobium pusense sp和Beijerinckia fluminensissp的同源性為99%，還需進行生理生化實驗及電鏡觀察形態來進一步確定種屬。該菌對pH的耐受范圍較大，在pH 5-10的條件下均能良好生長。3-Ⅰ菌株能夠以乙酸鈉為唯一碳源，硝酸鹽及亞硝酸鹽為氮源，搖瓶處理72h后在人工配水中硝酸鹽去除率高達99.9%，且無亞硝酸積累；在編號為W652、HJ121、HJ155三個地下水中的硝酸鹽去除率均高于99%，也無亞硝酸鹽積累。菌株3-Ⅰ在硝酸鹽人工配水和受硝酸鹽污染的北京地下水水樣中表現出優異的脫氮性能，具有一定的工程應用價值。

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李麗(1981—)，女，河北石家莊人，北京市水文地質工程地質大隊，碩士研究生，助理工程師，主要水資源保護方面的研究工作。