牛乳中大腸桿菌O157∶H7 PCR檢測方法的建立

劉　鑫，姚　笛，郭　瑜，張　微，佐兆杭，侯婷婷

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶　163319）

牛乳中大腸桿菌O157∶H7 PCR檢測方法的建立

劉鑫，姚笛，郭瑜，張微，佐兆杭，侯婷婷

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

為了建立牛乳中大腸桿菌O157∶H7的PCR快速檢測方法，試驗對大腸桿菌O157∶H7的rfbE基因序列進(jìn)行分析，設(shè)計1對特異性引物，對大腸桿菌O157∶H7的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合特異性和靈敏性試驗，實現(xiàn)對致病性大腸桿菌O157∶H7的檢測；然后將不同含量的大腸桿菌摻入到牛乳中進(jìn)行實際樣品的檢測。結(jié)果表明，該方法的特異性和靈敏性較好，能夠檢測到0.1 ng/μL的DNA模板，當(dāng)牛乳中含有超過100 CFU/mL的大腸桿菌時，可利用該方法進(jìn)行檢測。

大腸桿菌O157∶H7；PCR技術(shù)；檢測

大腸桿菌O157∶H7是一種腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC） 的代表菌株，它是能夠引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌［1］。大腸桿菌O157∶H7可產(chǎn)生大量毒素，從而引起出血性結(jié)腸炎等疾病［2］。自美國首次分離出該菌以后，O157∶H7的爆發(fā)和流行相繼出現(xiàn)在全球五大洲的20多個國家［3］。目前，我國還未對由大腸桿菌O157∶H7引起的食物中毒進(jìn)行比較系統(tǒng)的調(diào)查、分析和統(tǒng)計，但是從我國的飲食結(jié)構(gòu)、食品加工、貯藏和運輸條件等方面推測大腸桿菌O157∶H7的污染情況是比較嚴(yán)重的［4］。另外，大腸桿菌O157∶H7主要附著在人或動物的腸道內(nèi)，可通過糞便等多種途徑污染食品，為了保障食品的食用安全性，有必要對食品中的大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行快速檢測。

目前，大腸桿菌O157∶H7的檢測方法主要是常規(guī)的細(xì)菌學(xué)分離鑒定方法，該方法存在耗時長、過程復(fù)雜、靈敏性不強(qiáng)等缺點。酶聯(lián)免疫法（ELSIA）等免疫學(xué)方法需要進(jìn)行單克隆抗體的制備，建立該方法耗時、費力，且存在非特異性吸附等缺點［5］。PCR檢測方法具有快速、準(zhǔn)確的特點，可實現(xiàn)對致病菌的定性檢測［6］。因此，本研究以大腸桿菌O157∶H7的rfbE基因為靶序列，擬建立一種牛乳中大腸桿菌O157∶H7的PCR檢測方法，該技術(shù)與常規(guī)檢測相比具有更強(qiáng)的特異性和靈敏性。建立的方法能夠使牛乳中大腸桿菌O157∶H7的檢測更為快速和準(zhǔn)確，并為其他致病菌的快速檢測提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株

大腸桿菌O157∶H7、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌菌種，均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品生物技術(shù)實驗室保存。

1.1.2試劑

LB培養(yǎng)基，青島海博公司產(chǎn)品；rTaq（5 U/μL）、TaKaRa ExTaqTM（5 U/μL）、MgCl2（25 mmol/L）、DL2000 DNAMarker、dNTPs（10 mmol/L）、6×Loading Buffer等，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 L，在121℃下滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉15～20 g，蒸餾水1 L，在121℃下滅菌20 min。

1.1.4儀器設(shè)備

TGL-16B型臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器制造廠產(chǎn)品；9700型PCR基因擴(kuò)增儀，基因有限公司產(chǎn)品；JY04S-3B型電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品；YJ600+型凝膠成像系統(tǒng)，北京君意東方電泳有限公司產(chǎn)品。

1.2試驗方法

1.2.1細(xì)菌的培養(yǎng)

將大腸桿菌O157∶H7接種于LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)12 h。

1.2.2DNA模板的制備

取上述細(xì)菌培養(yǎng)液，以1%接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)過夜，取細(xì)菌培養(yǎng)液1.0 mL，置于EP管中，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心2 min，然后用ddH2O洗滌2次，最后加入300 μL ddH2O，隔水煮沸15 min，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心15 min，取上清液，即為DNA模板。置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

對于PCR特異性檢測所用的蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌的DNA模板制備均按照上述方法進(jìn)行，DNA模板置于-20℃下保存。

1.2.3引物的合成

根據(jù)Genebank發(fā)表的大腸桿菌O157∶H7 rfbE基因序列，利用Primer 5軟件設(shè)計特異性引物。上游引物：5'-CATCTTTACTTTCCTTGTGGACTT G-3'；下游引物：5'-AAACTATTACTACAGGTGAAGGTGG-3'。擴(kuò)增片段大小為261 bp，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.4PCR擴(kuò)增

以提取的基因組DNA為模版，使用設(shè)計的引物擴(kuò)增rfbE基因片段，反應(yīng)體系為 10×PCR buffer 2 μL，dNTP Mixture 1.5 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min；獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5特異性檢測

以提取的大腸桿菌O157∶H7、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌和沙門氏菌的DNA為模板，利用大腸桿菌rfbE基因的特異性引物進(jìn)行PCR檢測，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.6靈敏性檢測

測定大腸桿菌O157∶H7的DNA質(zhì)量濃度，用ddH2O對已知質(zhì)量濃度的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取100，10，1，0.1，0.01，0.001 ng/μL的DNA樣品1 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測該方法的靈敏性。

1.2.7PCR用于實際樣品的檢測

將大腸桿菌培養(yǎng)液用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，進(jìn)行菌數(shù)的測定，然后用生理鹽水進(jìn)行菌體的洗滌，分別將含有1.0×105，1.0×104，1.0×103，1.0×102CFU/mL的大腸桿菌接入10 mL滅菌牛乳中，使牛乳中分別含有1.0×104，1.0×103，1.0×102，10 CFU/mL的大腸桿菌，然后提取牛乳樣品的DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2　結(jié)果與分析

2.1大腸桿菌O157∶H7的PCR擴(kuò)增結(jié)果

蠟樣芽孢桿菌PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

由圖1可知，擴(kuò)增片段的大小在250 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2大腸桿菌O157∶H7的特異性檢測結(jié)果

以大腸桿菌O157∶H7、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌和沙門氏菌的DNA為模板，利用大腸桿菌rfbE基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

特異性檢測結(jié)果見圖2。

由圖2可知，只有大腸桿菌O157∶H7出現(xiàn)目的片段的擴(kuò)增，而其他能夠引起食物中毒的致病菌未見擴(kuò)增，說明該方法的特異性良好。

2.3大腸桿菌O157∶H7的靈敏性檢測結(jié)果

靈敏性檢測結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)DNA質(zhì)量濃度為0.1 ng/μL以上時可見特異性擴(kuò)增，而DNA質(zhì)量濃度為0.01 ng/μL時未見特異性擴(kuò)增，說明該方法的靈敏度較高，可達(dá)到0.1 ng/μL。

圖1　蠟樣芽孢桿菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2　特異性檢測結(jié)果

圖3　靈敏性檢測結(jié)果

2.4摻乳樣品的檢測結(jié)果

對大腸桿菌O157∶H7培養(yǎng)液進(jìn)行菌落計數(shù)，測得的菌落總數(shù)為9.0×108CFU/mL。對菌體洗滌稀釋后，分別提取不同摻乳樣品的DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

摻乳樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當(dāng)牛乳中分別含有1.0×104，1.0× 103，1.0×102CFU/mL的大腸桿菌時可見特異性擴(kuò)增，目的條帶為100～250bp。而牛乳中含有10 CFU/mL的大腸桿菌時未見特異性擴(kuò)增，說明牛乳中含有超過100 CFU/mL的大腸桿菌時，可利用該PCR方法進(jìn)行檢測。

圖4 摻乳樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果

3　結(jié)論

對大腸桿菌O157∶H7的rfbE基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合特異性和靈敏性試驗，實現(xiàn)對致病性大腸

桿菌O157∶H7的檢測；然后將不同CFU含量的大腸桿菌摻入到牛乳中進(jìn)行實際樣品的檢測。結(jié)果表明，該方法的特異性和靈敏性較好，能夠檢測到0.1 ng/μL的DNA模板，當(dāng)牛乳中含有超過100 CFU/mL的大腸桿菌時可利用該方法進(jìn)行檢測。因此，該PCR檢測方法可以應(yīng)用到實際樣品中大腸桿菌的檢測，檢測時間3～4 h，檢測速度快、靈敏度高。

［1］王培育.腸出血性大腸桿菌O157∶H7檢測技術(shù)進(jìn)展 ［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（19）：23-28.

［2］Li Y，F(xiàn)rey E，Mackenzie A M，et al.Human response to Escherichia coli O157:H7 infection：antibodies to secreted virulence factors［J］.Infect Immun，2013，68（9）：211-219.

［3］徐兆煒．英國（蘇格蘭） O157大腸桿菌干擾爆發(fā)流行 ［J］．預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志，1997，13（1）：65-69.

［4］林鷺芳，黃健利，鐘凌.漳州市首次檢出E.coli O157∶H7［J］．海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2002（4）：43-47.

［5］陳玲霞，丁洪強(qiáng).食品中大腸桿菌檢測方法研究進(jìn)展 ［J］．疾病監(jiān)測與控制雜志，2010，4（6）：325-326.

［6］宋宏新，李明亮.PCR檢測乳品中大腸桿菌的研究 ［J］.食品科學(xué)，2009，30（4）：260-263.◇

Establishment of PCR Method for Detection of Escherichia coli O157∶H7 in Milk

LIU Xin，YAO Di，GUO Yu，ZHANG Wei，ZUO Zhaohang，HOU Tingting
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

In order to establish PCR rapid detection method on Escherichia coli（E.coli）O157∶H7 of milk.The rfbE gene sequence of E.coli O157∶H7 is analyzed in the experiment and a pair of specific primers are designed.E.coli DNA is amplified by PCR，combined with the specificity and sensitivity experiments，the detection of pathogenic E.coli O157∶H7 is implemented.Then different content of E.coli are added to milk to detect the actual samples.The results show that this method had good specificity and sensitivity，can detected 0.1 ng/μL DNA template，when milk contains more than 100 CFU/mL E.coli，this method can be used for testing.

Escherichia coli O157：H7；PCR technology；detection

TS252.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.043

2015-11-12

劉鑫（1993— ），男，本科，研究方向為微生物檢測。