嬰幼兒配方乳粉中乳清蛋白含量測定方法

文/賽音呼格吉樂　于景華*（天津科技大學）

嬰幼兒配方乳粉中乳清蛋白含量測定方法

文/賽音呼格吉樂于景華*
（天津科技大學）

乳清蛋白具有獨特的生物學功能，是重要的蛋白來源。為此綜述了國內外關于嬰幼兒配方乳粉中乳清蛋白含量測定的方法以及相關乳制品中乳清蛋白含量的測定方法。

嬰幼兒配方乳粉；乳清蛋白；含量測定

乳清蛋白作為嬰幼兒生長發育過程中重要營養成分，比酪蛋白具有更高的營養價值，并且更容易被人體消化吸收。母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例為60︰40[1]，而牛乳中的蛋白質組成與人乳相比具有較大的差異，其中乳清蛋白與酪蛋白的比例約為20︰80。為了使以牛乳為原料的嬰兒配方乳粉更接近母乳，為嬰兒提供更利于其生長的營養，可適當添加符合相關規定的乳清粉或乳清蛋白粉作為營養強化劑。我國國家標準GB 10765-2010《嬰兒配方食品》[2]中有相關要求，即嬰兒配方食品中乳清蛋白含量應大于60%。熱處理是食品加工過程的必要手段，乳清蛋白中主要功能性組分α-乳白蛋白和β-乳球蛋白等會在這些熱處理過程中發生變性，而熱處理的時間和溫度會導致這些組分發生不同程度的變性，通常這些變性是影響乳品中乳清蛋白品質的重要因素，會影響其活性，降低其營養價值，并且對嬰幼兒的消化吸收造成不利影響[3]。因此，需要一個高效、準確并且適用于嬰幼兒配方乳粉的測定方法來為其有效的營養價值提供參考依據和檢測方法。目前，國內外關于乳清蛋白定量檢測方法的報道有很多，其中不乏一些新的方法和對舊方法的改進。因此，有必要總結多種乳清蛋白檢測方法，評價其優缺點，為今后優化檢測方法提供基礎。

1　SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳法

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）用于分離蛋白質和寡核苷酸時具有良好的效果，近些年被廣泛用于分離乳清蛋白。十二烷基硫酸鈉（SDS）是一種很強的陰離子表面活性劑，可以與蛋白質通過疏水相互作用結合。不同的蛋白質在具有分子篩效應的凝膠中發生遷移，從而實現彼此分離。該方法能有效地分離α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。目前我國國家標準GB/T 5413.2-1997《嬰幼兒配方食品和乳粉乳清蛋白的測定》[4]中就是采用了SDS-PAGE法。具體方法是：首先將凝膠放入電泳槽中，再加入緩沖液，試樣溶液與標準溶液的添加量為每孔10 μL，以10%～20%的梯度復合凝膠進行電泳，電流為40 mA，時間為60 min。酪蛋白與乳清蛋白會按分子量的順序分離開，采用光密度計對其進行測定，求得其顏色深度（OD）的積分值（=Trace值）。通過3 種酪蛋白（α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白）譜帶的Trace值計算出酪蛋白的比率，以及采用同樣的方法計算出乳清蛋白的比率[4]。

國標法對儀器設備的要求比較高，張杉等采用了普通的掃描儀和Bandscan軟件[5]。具體方法是：把實驗得到的凝膠進行掃描，用該軟件分析其條帶的灰度值，并通過灰度值和濃度之間的關系對電泳結果進行定量分析，在一定的濃度范圍內樣品的總灰度值和樣品濃度之間存在著線性關系[5]。而賈宏信等認為國標法存在一定的缺陷，因為不同的蛋白質結合考馬斯亮藍的能力不同，因此相同濃度的不同蛋白質會表現出不同的光密度值，從而導致檢測結果的準確度較低，誤差較大。因此，他們采用ChemiDoc XRS+成像系統的Quantity One圖像處理軟件處理圖像，得出不同蛋白條帶總的Trace值，然后計算乳粉內乳清蛋白占總蛋白的比例[6]。

不難看出，聚丙烯酰胺凝膠電泳法對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分離效果顯著，然而對β-乳球蛋白的2 種遺傳變異體β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B并不能進行有效的分離。

2　氨基酸折算法

氨基酸是組成蛋白質的基本結構單位，人體攝入蛋白質后會使其分解成氨基酸從而吸收利用；Association of Official Analytical Chemists（AOAC）標準起草人Wesley 等提出采用氨基酸模式來定量計算乳基嬰幼兒配方食品中乳清蛋白百分比[7]。AOAC關于乳基嬰幼兒配方奶粉中乳清蛋白的檢測標準是根據乳清蛋白和酪蛋白中的4種特征氨基酸，即天冬氨酸/天冬酰胺（Asx）、丙氨酸（Ala）、苯丙氨酸（Phe）和脯氨酸（Pro）的含量折算出嬰幼兒配方奶粉中乳清蛋白的百分比[8]。計算公式如下：

式中：R—特征氨基酸的比值；fw（%）—乳清蛋白百分比。

李爽等對氨基酸折算法計算嬰幼兒配方乳粉中乳清蛋白含量的方法進行了分析評價。結果表明，該氨基酸折算法對嬰幼兒配方乳粉中乳清蛋白含量的定量研究具有參考價值。然而添加大豆分離蛋白實驗的結果表明，添加大豆分離蛋白可明顯改變氨基酸組成，說明該氨基酸折算法評價嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方法只適用于乳基嬰幼兒配方乳粉，對含有豆基配方粉的產品不適用[9]。

3　高效液相色譜法

高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析[10]。趙海霞等采用C8色譜柱，流動相A為0.1%的三氟乙酸-水溶液，流動相B為0.09%的三氟乙酸-乙腈溶液，梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，二極管陣列檢測器的檢測波長為215 nm，柱溫為30 ℃[11]。外標法定量，α-La和β-Lg兩種組分線性關系良好，相關系數分別為0.9998和0.9984，檢測限分別為3 μg/mL、10 μg/mL，為定量測定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量提供有效方法[11]。

近年來反相液相色譜作為新興的色譜分離技術，其機理得到了深入的研究。在乳清蛋白測定方面反相液相色譜的應用也越來越廣泛。李慧等應用RP-HPLC在乳清蛋白中分離出α-乳白蛋白和β-乳球蛋白[12]。而王浩等采用RP-HPLC法在乳品中分離出7種蛋白質[13]。朱鑫鑫等采用RPHPLC法分離出BSA、α-La、β-LgB和β-LgA 4 種乳清蛋白成分，并且可以定量測定出未變性的乳清蛋白[14]。但是在此之前要將變性的乳清蛋白和酪蛋白去除，采用的方法是以鹽酸為pH值調節劑，用等電點沉淀法除去變性的乳清蛋白和酪蛋白[14]。以此方法可以檢測出乳清蛋白組分之間變性程度的差異和各種產品之間乳清蛋白量濃度的差異，可以為脫脂乳及脫脂乳粉中乳清蛋白成分的定性和定量提供可靠的測量方法。

由于常用的高效液相色譜柱填料的直徑為5 μm，導致需要花費較長時間來分離目標產物，因此超高效液相色譜技術（UHPLC）得以應用。UHPLC色譜柱填料的直徑降低為1.7～5.0 μm，固定相的粒徑越小，理論塔板高度越小，柱效也就越高[21]。

高效液相色譜法通常是通過紫外吸收來定量的。而蛋白質分子結構非常復雜，容易發生結構變性以及造成分離柱吸附。因此采用高效液相色譜法經常會出現實驗結果的回收率低和分離度差等問題，仍需要對實驗條件不斷地優化來降低誤差。

4　液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）

液相色譜-質譜聯用技術是近10 年來興起的新技術，相比于其它色譜方法，其具有更高的選擇性和靈敏度。近年來的一些研究也證明LC-MS技術在蛋白質分析領域具有較高的應用價值。Christoph C等[15]采用LC-MS聯用方法測定牛奶和乳制品中β-乳球蛋白的含量。而對于α-乳白蛋白，Ren Yiping等[16]采用UHPLC-MS聯用方法進行了測定，同時也可以測出β-乳球蛋白的含量。采用直徑1.7 μm的C18色譜柱，而流動相仍然采用0.1%的三氟乙酸水溶液和0.1%的三氟乙酸乙腈溶液[11]。

在此基礎上，張京順[17]應用UHPLC-MS聯用技術檢測出非變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，為了降低基質干擾，采用人乳α-乳白蛋白作為內標和空白基質。采用三氟乙酸、乙腈溶液作流動相。在質譜中定量檢測時采用選擇區間掃描方式，之后對所建立的方法分別進行室內方法學驗證，并且對收集到的相關產品進行了分析檢測，均獲得了較好的結果。

5　毛細管電泳法

毛細管電泳（CE）又稱高效毛細管電泳（HPCE），通常采用毛細管作為分離通道在高壓電場中進行分離。唐萍等[18]利用毛細管電泳法研究了乳制品中蛋白成分的分離與測定。利用檸檬酸緩沖體系，對牛奶中的α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg）、α-酪蛋白（α-CN）、β-酪蛋白（β-CN）、κ-酪蛋白（κ-CN）5 種蛋白進行了很好的分離。楊媛媛等[19]建立了高效毛細管電泳分離乳清蛋白中 α-La、β-LgA和β-LgB的方法，并且加入羥丙基-β-環糊精和聚氧化乙烯（PEO）為分離緩沖溶液來降低內壁吸附。張毅杰[20]采用硼酸鹽緩沖體系和自制的聚丙烯酰胺涂層毛細管，在紫外檢測波長214 nm，分離電壓20 kV條件下，很好地分離了牛奶中α-乳白蛋白（α-La）和β-乳球蛋白（β-Lg）。

對于毛細管電泳法，由于受到進樣量和電壓的限制，該方法的檢測靈敏度較低，從而導致實驗的準確性會相對較差一些。同時，毛細管內壁容易吸附堿性蛋白等生物大分子，會導致峰拖尾和展寬，甚至形成不可逆吸附使分離無法進行[19]。

6　其它方法

凝膠色譜（GC）是一種物理性分離方法。其原理是被分離的混合物在通過具有多孔網狀結構的凝膠顆粒時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠而從凝膠顆粒之間的空隙間流動，所以被最先洗脫出來；而比凝膠孔徑小的分子能不同程度地自由出入凝膠內外空隙，因而遷移的路徑變長且速率變慢，最后被洗脫出來[21]。但凝膠色譜分辨率較低，對于分子量差別比較小的蛋白質無法進行有效的分離，例如β-乳球蛋白的2 個遺傳變異體β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B，兩者之間僅有90 Da的分子量差異，故無法進行有效分離[16]。

毛細管電色譜技術（CEC）是以電滲流為驅動力，同時在毛細管內填充或在內壁涂覆、鍵合或交聯色譜固定相的一種微柱液相色譜技術[21]，近年在多肽和蛋白質的分離和分析上具有較好的表現。但是該技術在乳清蛋白的檢測和分析上報道不多，技術也相對不是很成熟。未來在乳清蛋白的分析檢測中，可以利用其極佳的分離特性對乳清蛋白各組分進行更好的分離分析。總之，該方法具有非常好的應用前景。

7　總結

綜上所述，SDS-PAGE法僅能分離出α-乳白蛋白（α-La）和β-乳球蛋白（β-Lg），并不能對β-乳球蛋白的2 種遺傳變異體——β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B進行有效分離。而很多方法對于經過一定加熱處理后的樣品，由于蛋白質變性，其測定結果與實際含量存在一定的誤差。每個方法也都存在一些系統性的缺點，導致實驗結果不理想。因此需要在特定的情況下應用相應的方法，例如僅需測定2 種主要乳清蛋白時采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，又或者在測定乳基嬰幼兒配方乳粉的乳清蛋白酪蛋白比例時采用氨基酸折算法。高效液相色譜法中反相高效液相色譜法應用較多，尤其是在對非極性和弱極性物質的分離中。而想要讓分離時間更短，可采用超高效液相色譜技術。通過采用質譜作為檢測系統，可獲得相對分子質量以及結構信息。毛細管電泳法較適合少量的樣品測定，而對于內壁吸附問題可加入聚氧化乙烯（PEO）以及羥丙基-β-環糊精來獲得較好效果。未來仍需不斷改良當前的方法，并對毛細管電色譜等新技術掌握越來越成熟，以達到最好的檢測效果。C

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國家自然科學基金（31271904）]

賽音呼格吉樂（1989-），男，在讀碩士研究生，研究方向為乳品科學與工程。

?于景華（1966-），男，教授，博士研究生，研究方向為乳品科學與工程。

（2016-05-05）