Nrf2通路在天麻素抑制油酸誘導的HL-7702細胞氧化應激中的作用

曲麗麗 于濱 孔維佳

1.中國醫學科學院藥物研究所，北京100050；2.中國醫學科學院醫藥生物技術研究所，北京100050

Nrf2通路在天麻素抑制油酸誘導的HL-7702細胞氧化應激中的作用

曲麗麗1于濱2孔維佳2

1.中國醫學科學院藥物研究所，北京100050；2.中國醫學科學院醫藥生物技術研究所，北京100050

目的研究核因子E2相關因子2（Nrf2）在天麻素（GSTD）抑制油酸（OA）誘導的肝細胞氧化應激中的作用。方法體外培養HL-7702細胞，以Nrf2特異性的小干擾RNA（siRNA）轉染細胞以沉默其表達，以濃度為100μg/mL的GSTD處理細胞24 h后提取細胞總蛋白以及核、質蛋白，以免疫印跡法檢測Nrf2和血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達水平。在抗氧化實驗中，Nrf2 siRNA轉染后以濃度為0.6 mmol/L的OA與GSTD共同處理細胞24 h，以試劑盒檢測細胞內超氧化物歧化酶（SOD）的活性以及活性氧簇（ROS）和丙二醛（MDA）的含量。結果與對照組細胞比較，Nrf2 siRNA轉染細胞后Nrf2總蛋白、細胞核內Nrf2蛋白和HO-1蛋白的基礎表達水平均顯著下降（P< 0.01）。與對照組細胞比較，GSTD使細胞核內Nrf2蛋白和HO-1蛋白的表達水平分別平均增加約90.2%和80.3%（P<0.01）。與單用GSTD處理的細胞比較，GSTD促進Nrf2蛋白細胞核轉位和上調HO-1表達的作用能被Nrf2 siRNA完全阻斷（P<0.001）。與對照組細胞比較，OA處理后可誘導細胞產生氧化應激（P<0.01）；與單加OA的細胞比較，GSTD與OA共同處理細胞后能使SOD的活力顯著增加，ROS和MDA的水平顯著下降（P<0.01）；與OA+GSTD組細胞比較，GSTD的抗氧化作用能被Nrf2 siRNA完全阻斷（P<0.001）。結論Nrf2通路在GSTD抑制OA誘導的HL-7702細胞氧化應激的活性中發揮關鍵作用。

天麻素；核因子E2相關因子2；基因沉默；油酸；氧化應激

天麻素（gastrodin，GSTD）是中藥天麻（Gastrodia elata Bi.）的主要有效成分之一，目前在臨床上主要用于神經系統疾病如癲癇、頭痛等的治療[1]。筆者實驗室前期的研究工作發現天麻和GSTD具有降血脂、降血糖和改善肝臟脂肪變性的藥理學作用[2-9]。肝細胞的脂肪變性是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的最主要病理學特點。在NAFLD的發生和發展過程中，氧化應激起著非常關鍵的作用[10]。筆者實驗室近期研究發現，GSTD在NAFLD的體內外模型中均可顯著抑制氧化應激[11]。GSTD可通過腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）依賴的方式來激活肝細胞中的核因子E2相關因子2（Nrf2）通路，促進Nrf2的細胞核轉位[11]。Nrf2是一種抗氧化轉錄因子，被激活后能進入細胞核，促進其靶基因如血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達，從而發揮抗氧化作用[12-13]。筆者實驗室上述的研究工作闡明了AMPK在GSTD的抗氧化活性中所發揮的關鍵作用，但Nrf2的作用仍需進一步確證。本研究以Nrf2特異性的小干擾RNA（siRNA）來沉默其表達，并觀察對GSTD抗氧化藥效的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

GSTD購自浙江誠意藥業有限公司，批號20120509，純度逸98%。油酸（OA）和牛血清白蛋白（BSA）購自美國Sigma公司。胎牛血清（FBS）、DMEM培養基、非必需氨基酸、1%雙抗（青霉素與鏈霉素）購自美國GIBCO公司。人源的Nrf2 siRNA購自美國Santa Cruz公司；X-treme Gene siRNA Transfection Reagent購自美國R&D公司；Opti-MEMR培養基購自美國Invetrogen公司。M-PERRMammalian蛋白裂解液、HaltR蛋白酶&磷酸酶雙重抑制劑、細胞核質蛋白分離提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Scientific公司。Nrf2、HO-1、茁-肌動蛋白（ACTB）、組蛋白H3（histone H3）的單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司。PVDF膜購自美國Millipore公司。總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒和活性氧（ROS）檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養HL-7702細胞常規培養于含10% FBS、1%非必需氨基酸和雙抗（100 U/mL青霉素+ 100 U/m L鏈霉素）的DMEM培養基中，在37毅C含5%CO2的培養箱中培養。每次實驗前將細胞按2伊105個/孔接種至6孔板，待長至70%~80%滿時，換成無血清培養基，饑餓24 h后進行實驗。

1.2.2 si RNA沉默實驗用X-treme Gene siRNA Transfection Reagent按照試劑盒說明，將Nrf2 siRNA轉染細胞。轉染6 h后，棄去原培養基，換為含10% FBS的完全培養基，繼續培養24 h，細胞饑餓后進行相應處理。

1.2.3 藥物處理GSTD以滅菌生理鹽水溶解，濃度為10mg/mL，以DMEM培養基稀釋100倍后（100μg/mL）處理細胞，時間為24 h。OA以滅菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）+5%BSA溶解，制備成濃度為6 mmol/L的儲備液，分裝后-20益保存。在GSTD的抗氧化實驗中，OA以DMEM培養基稀釋10倍（0.6 mmol/L）后與GSTD共同處理細胞24 h。實驗中每個處理孔重復3~4次。

1.2.4 免疫印跡實驗使用相應試劑盒按照說明書要求提取細胞總蛋白或分離細胞核質蛋白；蛋白定量后，使用含30μg蛋白的樣品以10%分離膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。參考文獻[11]，依次轉膜、封閉、與一抗孵育、洗膜后再與二抗孵育并顯色、定量。細胞總蛋白及細胞質蛋白中目標蛋白的表達水平以ACTB為內參，細胞核中目標蛋白的表達水平以histone H3為內參，校正后以對照組細胞的倍數表示。

1.2.5 細胞內SOD、ROS、MDA含量檢測分別使用相應試劑盒，按照說明書并參考文獻[12]測定細胞內的SOD活力、ROS水平以及MDA含量。上述指標以樣品中的蛋白濃度為參照進行校正后以對照組細胞的百分數（%）表示。

1.3 統計學方法

使用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數依標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Nrf2 siRNA阻斷GSTD對Nrf2通路的激活作用

本研究以特異性siRNA沉默Nrf2表達，觀察其對GSTD激活Nrf2通路的影響。結果如圖1所示，與對照組細胞比較，Nrf2 siRNA轉染HL-7702細胞后Nrf2總蛋白的基礎表達水平顯著降低（P<0.01）；相應地，其靶基因HO-1的基礎表達水平也被顯著抑制（P<0.01），證明Nrf2 siRNA有效地沉默了Nrf2基因的表達。

與對照組細胞比較，Nrf2 siRNA沉默Nrf2的表達后，使細胞核和細胞質中Nrf2蛋白的基礎水平顯著下降（P<0.01）。見圖2。單用GSTD處理細胞不影響Nrf2總蛋白的水平（圖1），但可顯著增加其細胞核轉位平均約90.2%，從而使其在細胞質中的濃度下降平均約55.0%，與對照細胞組比較差異有高度統計學意義（P<0.01）。見圖2。重要的是，本研究發現GSTD增加Nrf2蛋白細胞核轉位的作用能夠被Nrf2 siRNA所完全阻斷，與單加GSTD處理的細胞比較，差異有高度統計學意義（P<0.001），見圖2。相應地，GSTD上調HO-1蛋白表達（平均約80.3%）的作用也被Nrf2 siRNA完全阻斷，與單加GSTD處理的細胞比較，差異有高度統計學意義（P<0.001），見圖1。

圖1 Nrf2 siRNA對HL-7702細胞Nrf2/HO-1表達及GSTD上調HO-1作用的影響

圖2 Nrf2 siRNA對Nrf2蛋白細胞核轉位的影響

2.2 Nrf2 siRNA阻斷GSTD抑制OA誘導的氧化應激作用

結果如圖3所示，OA處理后可誘導HL-7702細胞發生氧化應激，表現為SOD活力的顯著下降，ROS和MDA水平的顯著增加，與對照組細胞比較，差異有高度統計學意義（P<0.01）。Nrf2 siRNA轉染后導致OA誘導的氧化應激進一步惡化，表現為SOD活力的進一步下降，MDA和ROS水平進一步增加，與單加OA的細胞比較，差異有統計學意義（P<0.05）。這些結果與Nrf2 siRNA減少Nrf2和HO-1的基礎表達水平的作用相一致。

與筆者之前的報道相一致[11]，GSTD顯著抑制OA誘導的氧化應激，使細胞中SOD的活力恢復到接近正常，而ROS和MDA的水平顯著下降，與單加OA的細胞比較，差異有高度統計學意義（P<0.01）。重要的是，GSTD的抗氧化活性被Nrf2 siRNA轉染所完全阻斷，與OA+GSTD組細胞比較，差異有高度統計學意義（P<0.001）。見圖3。表明siRNA的沉默結果證明Nrf2通路在GSTD的抗氧化活性中發揮關鍵作用。

圖3 Nrf2 siRNA對GSTD抗氧化活性的影響

3 討論

Nrf2是細胞中重要的抗氧化分子，目前認為，其也是治療代謝性疾病如糖尿病、NAFLD、肥胖癥等的重要潛在靶點[12-13]。本研究發現其在GSTD的抗氧化活性中發揮關鍵作用。本研究使用了基因沉默的方法，結果首次發現肝細胞中Nrf2的表達被抑制以后阻斷了GSTD刺激其蛋白細胞核轉位的作用以及對其靶基因HO-1的上調作用，進而抑制了GSTD的抗氧化活性。

筆者之前的實驗結果顯示，GSTD處理HL-7702細胞后不增加Nrf2總蛋白的表達水平，但能夠顯著促進其細胞核轉位[11]，本文的結果再次證明了這一點。與本文的結果相對照，有研究報道GSTD在神經細胞中能顯著上調Nrf2 mRNA和蛋白的表達水平從而發揮抗氧化作用[14]。此發現從一個側面支持了本文的結論，并提示GSTD在不同的組織中對Nrf2有不同的調控作用。在下一步的實驗中，將使用Nrf2的表達載體對其在肝細胞中進行過表達，觀察對GSTD的抗氧化活性是否有促進作用，以進一步確認該分子在GSTD藥理活性中的關鍵作用。

除了抗氧化活性，Nrf2還具有細胞保護和抗纖維化的作用[15]。文獻報道GSTD對神經細胞和肝細胞都有保護作用[16-18]，還能顯著抑制飲食誘導[11]或膽管結扎[19-20]誘發的大鼠肝纖維化。GSTD的肝保護和抑制肝纖維化的作用是否也與Nrf2通路的激活有關值得深入研究。

綜上所述，本文的研究結果證明，植物來源的天然產物GSTD通過激活肝細胞中的Nrf2通路來抑制OA誘導的氧化應激。結合筆者實驗室之前的研究結果[11]，提示GSTD未來可開發用于治療NAFLD以抑制氧化應激，延緩NAFLD的病情進展。

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Effects of Nrf2 pathway in the activity of gastrodin in suppressing oleic acid-induced oxidative stress in HL-7702 cells

QU Lili1YU Bin2KONGWeijia2
1.Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100050,China;2.Institute of Medicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100050,China

Objective To investigate the role of nuclear factor erythroid-2-related factor-2(Nrf2)in the activity of gas-trodin(GSTD)in suppressing oleic acid-(OA-)induced oxidative stress in hepatocytes.Methods HL-7702 cells were cultured in vitro,small interfering RNA(siRNA)specific for Nrf2 was used to transfect the cells in order to silence its expression.GSTD at a concentration of 100μg/mL was used to treat the cells for 24 h;cell total proteins,nuclear and cytoplasmic proteins were extracted for Western blot analysis of the expression levels of Nrf2 and heme oxygenase-1 (HO-1).In the antioxidant experiments,cells were treated with 0.6 mmol/L of OA together with GSTD for 24 h after Nrf2 siRNA transfection.Intracellular superoxide dismutase(SOD)activity,reactive oxygen species(ROS)andmalondi-aldehyde(MDA)levelswere determined by kits.Results Compared with the control cells,after the transfection of Nrf2 siRNA,the cellular baseline expression levels of total Nrf2,nuclear Nrf2 and HO-1 proteins declined greatly(P< 0.01).Compared with the control cells,GSTD increased the nuclear Nrf2 protein and HO-1 protein levels averagely by 90.2%and 80.3%,respectively(P<0.01).Compared with cells treated with GSTD alone,the stimulating activities of GSTD on the nuclear translocation of Nrf2 protein and the expression of HO-1 were totally blocked by Nrf2 siRNA (P<0.001).Compared with the control cells,the cells developed oxidative stress after the administration of OA(P< 0.01).Compared with cells treated with OA alone,when GSTD was co-administered with OA,the SOD activity in-creased but the levels of ROS and MDA decreased greatly in HL-7702 cells(P<0.01).Compared with cells treated with OA+GSTD,the antioxidant activity of GSTD could be blocked by Nrf2 siRNA completely(P<0.001).Conclusion The Nrf2 pathway plays a critical role for the activity of GSTD in suppressing OA-induced oxidative stress in HL-7702 cells.

Gastrodin;Nuclear factor erythroid-2-related factor-2;Gene silencing;Oleic acid;Oxida-tive stress

R965

A

1673-7210（2016）07（a）-0010-04

院2016-04-02本文編輯院程銘）

曲麗麗（1985.7-），女，北京協和醫學院2012級藥理學專業在讀博士研究生；研究方向院代謝性藥物分子藥理學。

孔維佳（1972.12-），男，博士，研究員；研究方向院分子醫學與藥物研究。