全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)在運(yùn)動(dòng)遺傳資源利用中的潛在價(jià)值與展望

張澤彪，趙玉華，周文婷，趙晨瓊，張 穎，朱志強(qiáng)，關(guān)偉軍

（1.哈爾濱體育學(xué)院，黑龍江 哈爾濱　150008；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京　100193）

全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)在運(yùn)動(dòng)遺傳資源利用中的潛在價(jià)值與展望

張澤彪1，2，趙玉華1，周文婷1，趙晨瓊1，張 穎1，朱志強(qiáng)1，關(guān)偉軍2

（1.哈爾濱體育學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150008；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃(human genome project， HGP)的完成，人們對(duì)當(dāng)前自身遺傳信息有了新的認(rèn)識(shí)。無(wú)奈不同條件下基因表達(dá)水平變化各有差異，從而造成不同個(gè)體生理表型與功能上的迥然不同。隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，構(gòu)建高質(zhì)量的全長(zhǎng) cDNA 文庫(kù)成為當(dāng)前研究者們研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)的重要技術(shù)手段之一。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)目前有四種全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)已趨于成熟，應(yīng)用更為普遍，但在運(yùn)動(dòng)科學(xué)領(lǐng)域至今卻無(wú)人提及。詳述近年來(lái)幾種技術(shù)現(xiàn)已成熟的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法及特點(diǎn)，并對(duì)其應(yīng)用性進(jìn)行概述，推測(cè)其在運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域同樣存在潛在的應(yīng)用價(jià)值，若以此法對(duì)運(yùn)動(dòng)員遺傳資源加以利用，預(yù)計(jì)將會(huì)運(yùn)動(dòng)科學(xué)的發(fā)展發(fā)揮重要影響。

優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員；全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)；遺傳資源；應(yīng)用價(jià)值

隨著我國(guó)2022年北京—張家口冬季奧林匹克運(yùn)動(dòng)會(huì)的申辦成功，全國(guó)備戰(zhàn)冬奧的準(zhǔn)備正如火如荼的開(kāi)展。目前我國(guó)冬奧項(xiàng)目在運(yùn)動(dòng)能力開(kāi)發(fā)[1]。生物學(xué)監(jiān)控[2]及運(yùn)動(dòng)損傷[3]等方面的研究較為廣泛，其中基因?qū)\(yùn)動(dòng)能力的作用更是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)話題。隨著分子生物學(xué)研究的開(kāi)展，基因組文庫(kù)的構(gòu)建成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究的一項(xiàng)重要手段，其中cDNA文庫(kù)作為研究功能基因的手段之一，引領(lǐng)功能基因組學(xué)的研究[4]。cDNA文庫(kù)是指以細(xì)胞或組織中全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后形成cDNA，與載體連接后轉(zhuǎn)化受體菌形成的重組DNA克隆群，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因的識(shí)別和剪接變異體，以及作為全長(zhǎng)基因克隆和大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的重要基礎(chǔ)，是大規(guī)模獲得基因序列信息，了解基因編碼蛋白相互作用關(guān)系和開(kāi)展功能基因組研究的重要途徑[5-6]。時(shí)至今日，運(yùn)動(dòng)科學(xué)領(lǐng)域研究已不拘泥于生物學(xué)監(jiān)控、技術(shù)動(dòng)作分析、運(yùn)動(dòng)損傷與心理調(diào)控等方面，近年來(lái)隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)等學(xué)科的相繼興起，使得通過(guò)生物技術(shù)手段對(duì)運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行研究成為了當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[7-8]，標(biāo)志著運(yùn)動(dòng)科學(xué)領(lǐng)域進(jìn)入到了“運(yùn)動(dòng)分子生物學(xué)”這一新時(shí)代。以往研究表明，個(gè)體之間運(yùn)動(dòng)能力差異受多種因素影響，其中環(huán)境和遺傳因素在個(gè)體間運(yùn)動(dòng)能力的差異方面起很大程度作用[9]，為了更為深入的研究巔峰狀態(tài)下運(yùn)動(dòng)員機(jī)體相關(guān)基因表達(dá)水平，cDNA文庫(kù)的應(yīng)用將有效解決遺傳資源與環(huán)境和訓(xùn)練干預(yù)之間的矛盾，反映特定組織或細(xì)胞某一階段或功能狀態(tài)下所有的遺傳信息，從而在轉(zhuǎn)錄組水平研究基因結(jié)構(gòu)與功能，揭示特定生物學(xué)過(guò)程的分子機(jī)制。截至目前cDNA文庫(kù)構(gòu)建在其他領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛，但在運(yùn)動(dòng)科學(xué)中的研究卻鮮有報(bào)道，故本文結(jié)合近年來(lái)不同cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法、特點(diǎn)及應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行綜述，以期為優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員的遺傳資源利用提供一條新的有效途徑，并為我國(guó)2022年冬奧會(huì)備戰(zhàn)期間的運(yùn)動(dòng)選材及運(yùn)動(dòng)能力開(kāi)發(fā)，開(kāi)展運(yùn)動(dòng)基因功能研究指明方向和提供理論依據(jù)。

1　全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法概述

自1976年首例cDNA文庫(kù)問(wèn)世至今，cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法層出不窮，而關(guān)于全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建的報(bào)道則直至18年后才由日本科學(xué)家Kato等人在研究中首次提及[10-11]。隨著分子克隆技術(shù)的快速發(fā)展，構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的手段。效率與質(zhì)量也發(fā)生了很大程度的改善，現(xiàn)根據(jù)幾種具有代表性的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法、原理和特點(diǎn)進(jìn)行概述，從而對(duì)其作出客觀的評(píng)價(jià)與分析。

1.1SMART法

利用SMART(Switching Mechanism At 5'end of the RNA Transcript)法構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)最早于1996年由Chenchik等學(xué)者提出，后經(jīng)Clonetech公司對(duì)其技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)并得以推廣，該技術(shù)主要原理是依據(jù)全長(zhǎng)cDNA的合成是借助Powerscript TMRT的末端轉(zhuǎn)移酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的[12-13]。由于mRNA3’末端具有特異的polyA尾結(jié)構(gòu)，反轉(zhuǎn)錄時(shí)利用一個(gè)Oligo(dT)與其發(fā)生特異性結(jié)合，從而引導(dǎo)ss–cDNA的合成，當(dāng)反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行到mRNA5’端帽子結(jié)構(gòu)時(shí)，PowerscriptTM RT活性才能達(dá)到最佳效果，能夠在fi rst–strand cDNA的3’末端添加上一段寡聚核苷酸序列Oligo(dC)，進(jìn)而保證全長(zhǎng)cDNA的完整性。因?yàn)橛糜诤铣蒫DNA第二鏈的引物只能結(jié)合3’端含Oligo(dC)的全長(zhǎng)cDNA，不能與短片段cDNA結(jié)合，因而最終得到的是全長(zhǎng)的ds–cDNA，從而保證后續(xù)全長(zhǎng)cDNA的完整性[4，14]。而對(duì)于非全長(zhǎng)的cDNA而言，因反轉(zhuǎn)錄無(wú)法延伸到mRNA5’末端，反轉(zhuǎn)錄便不能在其3’末端加上Oligo(dC)，所以在合成第二鏈時(shí)引物便不能與第一鏈模互不結(jié)合，所以便得不到全長(zhǎng)的cDNA，具體實(shí)驗(yàn)流程[4]如圖1所示。

不僅如此，SMART技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中在雙鏈cDNA引物的5’端引入Sfi I A–Sfi I B識(shí)別位點(diǎn)，所以只需對(duì)目的cDNA進(jìn)行Sfi I單酶切，便可實(shí)現(xiàn)目的基因的定向克隆。與其他方法相比，該技術(shù)的獨(dú)特之處在于對(duì)原始材料RNA的用量無(wú)需特殊處理，減少樣品的用量，實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單易行，獲得全長(zhǎng)cDNA的含量較高[14]。SMART法設(shè)計(jì)思路固然巧妙，但也不免存在一定的缺陷，例如基因內(nèi)部的寡聚dC影響全長(zhǎng)cDNA加尾效率，導(dǎo)致文庫(kù)文庫(kù)中全長(zhǎng)cDNA的比例有所下降，使文庫(kù)缺乏代表性。其次PCR具有“選擇性擴(kuò)增”的缺陷，不利于長(zhǎng)片段序列的擴(kuò)增，致使一些大于3 000bp的基因無(wú)法完全擴(kuò)增出來(lái)，導(dǎo)致文庫(kù)冗余性過(guò)強(qiáng)。

為使SMART法更加完善，許多研究者對(duì)該技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。例如Chenchik[15]在原有實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將MnCl2及BSA引入到單鏈cDNA合成的緩沖液中以此提高反轉(zhuǎn)錄的延伸效率。也有人通過(guò)減少LD–PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)，將循環(huán)參數(shù)設(shè)置在20–22 cycle從而保證全長(zhǎng)基因在文庫(kù)中所占比例，降低文庫(kù)冗余程度[16]。而Wellenreuther等人通過(guò)將瓊脂糖電泳分級(jí)技術(shù)與SMART法結(jié)合，提高文庫(kù)中全長(zhǎng)cDNA的比例，該方法[17]現(xiàn)已得到廣泛應(yīng)用且倍受各領(lǐng)域研究者們青睞。

1.2Oligo-capping法

Oligo–capping法構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)于1994年由SumioSugano實(shí)驗(yàn)室率先研發(fā)，其基本原理是利用一個(gè)寡聚核苷酸鏈替換mRNA的帽子結(jié)構(gòu)以達(dá)到標(biāo)記mRNA 5’端的目的，從而獲得全長(zhǎng)的cDNA[18]。具體操作主要依據(jù)完整的mRNA在5’末端含有帽子結(jié)構(gòu)，而降解的mRNA則無(wú)此特點(diǎn)，首先通過(guò)利用細(xì)菌堿性磷酸酶處理總mRNA，從中水解不完整的mRNA5’端的磷酸基團(tuán)，以防止后續(xù)反應(yīng)中短缺的mRNA與寡核苷酸發(fā)生連接。之后用煙草酸焦磷酸酶除去全長(zhǎng)mRNA5’端的帽子結(jié)構(gòu)，使磷酸基團(tuán)充分的暴露出來(lái)，以便通過(guò)RNA連接酶在其上面連上一個(gè)寡聚核糖核酸序列，并以此作為引發(fā)第二鏈合成的引物結(jié)合位點(diǎn)，之后才能通過(guò)PCR擴(kuò)增出全長(zhǎng)的cDNA，最后通過(guò)酶切。連接載體，從而達(dá)到構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的目的，實(shí)驗(yàn)過(guò)程[19]如圖2所示。

為完善該實(shí)驗(yàn)，有人以少量總RNA作為起始材料，防止酶處理過(guò)程中大量mRNA發(fā)生降解，起到保護(hù)mRNA的作用，因此改進(jìn)后的方法不僅減少了原始材料的用量，提高文庫(kù)構(gòu)建效率，且文庫(kù)代表性方面也優(yōu)于原始技術(shù)[20]。而后，為提高全長(zhǎng)cDNA在文庫(kù)中所占比例，Clepet C等[21]對(duì)該技術(shù)做了一些改進(jìn)，以DNA連接酶取代RNA連接酶，以提高寡核苷酸mRNA的連接效率。

Oligo–capping法主要優(yōu)勢(shì)在于實(shí)驗(yàn)快速–簡(jiǎn)單–文庫(kù)特異性高等特點(diǎn)，但該方法也存在著些許不足之處。首先，與其他技術(shù)相比，此方法需要大量mRNA作為原始材料，其次，反應(yīng)過(guò)程涉及多種酶促反應(yīng)，酶的活性直接影響文庫(kù)最終質(zhì)量。另外，該方法涉及PCR反應(yīng)，有些基因由于自身結(jié)構(gòu)的特異性無(wú)法通過(guò)PCR擴(kuò)增，導(dǎo)致文庫(kù)中某些克隆缺失。擴(kuò)增比例失調(diào)。使得文庫(kù)缺乏代表性，從而導(dǎo)致文庫(kù)難以反映組織或細(xì)胞中各基因的真實(shí)表達(dá)情況。

圖1　SMART法全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建流程示意圖Figure 1 Constructing process of full-length cDNA library with SMART method

圖2　Oligo-capping法全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)原理示意圖Figure 2　Principle of full-length cDNA library with Oligo-capping method

1.3CAP-ture法

利用CAP–ture法構(gòu)建cDNA文庫(kù)最早始于1995年由Edery等人，該方法是利用真核生物mRNA5’端帽子結(jié)構(gòu)可與“帽子結(jié)合蛋白”(轉(zhuǎn)錄起始因子A–EIF–4E)相互作用的原理獲得全長(zhǎng)cDNA[22]，如圖3。首先，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將mRNA合成雙鏈的cDNA–mRNA復(fù)合體，隨后用RNaseA對(duì)cDNA–mRNA復(fù)合體進(jìn)行酶切處理除去反轉(zhuǎn)錄中因反應(yīng)不徹底而呈單鏈游離存在的mRNA，而后利用A–EIF–4E對(duì)mRNA5’端甲基化的帽子結(jié)構(gòu)具有親和作用，將含有帽子結(jié)構(gòu)的完整mRNA與沒(méi)有帽子結(jié)構(gòu)不完整的mRNA區(qū)分開(kāi)，只有結(jié)合了A–EIF–4E甲基化帽子的mRNA與其對(duì)應(yīng)的才是全長(zhǎng)的cDNA，然后根據(jù)動(dòng)力學(xué)原理將A–EIF–4E上結(jié)合的m7GDP替換下來(lái)從而達(dá)到洗脫全長(zhǎng)cDNA的目的，最后經(jīng)純化–富集[23]后才能達(dá)到構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的要求。

該方法與其他技術(shù)相比之下優(yōu)勢(shì)在于酶促反應(yīng)較少，降低了mRNA降解風(fēng)險(xiǎn)， 此外無(wú)PCR反應(yīng)，降低文庫(kù)冗余性，提高文庫(kù)中全長(zhǎng)cDNA比率。但該方法因操作過(guò)程復(fù)雜，對(duì)mRNA的使用量較大，成本較高，不適用于樣品量較低的實(shí)驗(yàn)使用。此外，試驗(yàn)中A–EIF–4E獲取及純化過(guò)程繁瑣且只特異性的綁定甲基化的帽子結(jié)構(gòu)，對(duì)非甲基化的帽子幾乎無(wú)綁定能力，從而導(dǎo)致5’端非甲基化帽子的完整 mRNA 信息丟失；嚴(yán)格的意義上講，該方法在親和蛋白與帽子結(jié)合時(shí)，mRNA5’端會(huì)丟失10～50bp的堿基，所以并非實(shí)際上的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，不利于后續(xù)分析[24]。考慮到試驗(yàn)中存在諸多不利因素，因此該方法目前只能作為理論上的一種研究[25]，很難在全長(zhǎng)文庫(kù)構(gòu)建的實(shí)踐中得到應(yīng)用。

圖3　CAP-ture法全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)原理Figure 3　Constructing experimental principle of full-length cDNA library with CAP-ture method

1.4CAP–trapper法

CAP–trapper法于1996年由Carninci等人在全長(zhǎng)cDNA的研究中首次進(jìn)行報(bào)道，并以此方法成功的構(gòu)建了小鼠腦細(xì)胞的cDNA文庫(kù)[26]。該方法原理利用mRNA5’端和3’端最末位的核糖上都存在兩個(gè)相鄰的羥基結(jié)構(gòu)可被高碘酸鈉氧化，此結(jié)構(gòu)經(jīng)氧化后可與生物素結(jié)合而被標(biāo)記。經(jīng)生物素化的mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的含有標(biāo)記物的cDNA/mRNA雜合體通過(guò)RnaseI處理，去除所有非全長(zhǎng)cDNA5’端及所有未被cDNA保護(hù)的mRNA的，經(jīng)免疫磁珠吸附，并使用弱堿降解mRNA，從而獲得單鏈全長(zhǎng)cDNA，在末端轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，對(duì)5’端oligo(G)加尾，以此為模板合成第二鏈，最后定向克隆即可獲得全長(zhǎng)的cDNA文庫(kù)，其實(shí)驗(yàn)流程如圖4。

最早為提高全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)質(zhì)量，研究者們對(duì)該方法進(jìn)行了不同形式的改進(jìn)。首先為保證全長(zhǎng)cDNA合成效率有人在反轉(zhuǎn)錄體系中引入海藻糖和山梨醇以提高反轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性，保證反轉(zhuǎn)錄酶的活性在55℃～60℃的高溫下發(fā)揮最大效率。其次，用核糖核酸單鏈連接法加尾，減少Oligo(G)加尾對(duì)測(cè)序和蛋白質(zhì)翻譯的干擾，利于全長(zhǎng)cDNA的有效轉(zhuǎn)錄。但是該方法的實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高。操作復(fù)雜流程長(zhǎng)，加之mRNA長(zhǎng)期暴露在含酶的反應(yīng)體系中極易降解，因此實(shí)踐中有所受限。

CAP–trapper技術(shù)已日趨成熟，較之其他方法相比具有一定的獨(dú)到之處。由于該方法不采用PCR技術(shù)從而減少了文庫(kù)的冗余性，使文庫(kù)具有相對(duì)較好的代表性和較高的全長(zhǎng)比率。但由于該方法使用過(guò)多的氧化酶，致使mRNA暴露時(shí)間長(zhǎng)，增加了降解的風(fēng)險(xiǎn)，與此同時(shí)部分降解的RNA 5’端也被生物素標(biāo)記，造成假陽(yáng)性的出現(xiàn)。此外，實(shí)驗(yàn)流程繁瑣復(fù)雜，各階段反應(yīng)不便于控制，所以對(duì)實(shí)驗(yàn)者需要有較高的操作技術(shù)[27]才能保證文庫(kù)的質(zhì)量。

全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法除上述四種外還有許多，但因其操作復(fù)雜。試驗(yàn)周期較長(zhǎng)。技術(shù)不夠成熟等原因在此便不一一贅述。綜上所述，四種cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法目前研究較為深入，其中以Clonetech公司為代表的SMART技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，已成為構(gòu)建cDNA文庫(kù)的主流趨勢(shì)，但上述幾種文庫(kù)構(gòu)建方法各有利弊，所以還需依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康男枨髞?lái)選擇合適的方法。

圖4　CAP-trapper法全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)路線圖Figure 4　Constructing technique route of full-length cDNA library with CAP-trapper method

2　構(gòu)建cDNA文庫(kù)的關(guān)鍵因素

從以往研究我們不難看出，采用任何方法進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建都面臨以下幾個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題，即：mRNA的完整性與文庫(kù)的最終質(zhì)量，只有保證上述幾個(gè)關(guān)鍵的因素的要求，才可滿(mǎn)足后續(xù)研究的使用與需要。

2.1RNA獲取及其質(zhì)量評(píng)定

作為反轉(zhuǎn)錄的重要原料，RNA的質(zhì)量直接影響文庫(kù)最終效果，根據(jù)不同組織樣品來(lái)源的差異，RNA提取方法并無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，傳統(tǒng)的Trizol法當(dāng)前使用較為廣泛，而Ambion公司的MessageAmp? Bacteria II RNA Amplifi cation Kit試劑盒不僅對(duì)提取與純化過(guò)程進(jìn)行改良，而且在反轉(zhuǎn)錄合成cDNA之前對(duì)mRNA進(jìn)行擴(kuò)增使其含量增加至1 500倍之多，現(xiàn)已得到廣泛應(yīng)用，深受研究者們好評(píng)[28]。但為保證文庫(kù)構(gòu)建質(zhì)量，首先還需對(duì)所獲取的總RNA純度進(jìn)行紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，其中OD260/OD280代表總RNA的純度，當(dāng)該指標(biāo)在1.8～2.0范圍內(nèi)時(shí)，表明RNA的純度較好，無(wú)蛋白質(zhì)或酚及異硫氰酸等雜質(zhì)污染[29]。其次，利用RNA易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的原理，采用甲醛變性膠進(jìn)行RNA電泳，以此反映RNA質(zhì)量的真實(shí)情況，當(dāng)電泳檢測(cè)28S與18S處有兩條明顯條帶，且二者灰度值比約為2∶1時(shí)即可以證明RNA的完整性良好[16，30]可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

2.2文庫(kù)質(zhì)量的評(píng)定

已有研究表明，鑒定cDNA文庫(kù)的質(zhì)量需從三個(gè)方面進(jìn)行：首先根據(jù)Clareke公式：Pfu/ml=噬菌斑個(gè)數(shù)×稀釋倍數(shù)×103/鋪板稀釋噬菌體體積(μl)來(lái)計(jì)算文庫(kù)滴度。只有當(dāng)cDNA文庫(kù)包含至少1.7×105獨(dú)立克隆才可確保99％豐度的mRNA呈現(xiàn)在庫(kù)當(dāng)中，其次插入基因長(zhǎng)度應(yīng)在0.1 kb以上，確保完整cDNA的富集與完整，最后重組率[16]應(yīng)達(dá)到90％以上同樣作為一個(gè)評(píng)價(jià)文庫(kù)質(zhì)量的重要指標(biāo)。

3　cDNA文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)的應(yīng)用

cDNA文庫(kù)在基因克隆。功能鑒定，及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方面的特殊優(yōu)勢(shì)，使其在生物遺傳資源的研究中具有更為廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

3.1篩選功能性基因

cDNA是由mRNA反轉(zhuǎn)錄而來(lái)，能夠較容易地克隆細(xì)胞或組織特異性表達(dá)的基因，此外，與基因組文庫(kù)相比，cDNA文庫(kù)無(wú)內(nèi)含子序列對(duì)相關(guān)基因性狀的影響，相比之下文庫(kù)囊括性更為具體：包含轉(zhuǎn)錄信息更為廣泛，因此在基因克隆和篩選方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。早在1997年，McPherron等人通過(guò)構(gòu)建小鼠骨骼肌cDNA文庫(kù)，從中篩選出肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，MSTN)基因，通過(guò)敲除該基因的小鼠，發(fā)現(xiàn)MSTN 可明顯的負(fù)向調(diào)控骨骼肌的增長(zhǎng)并引起雙肌性狀[28]，此后的研究相繼證實(shí)MSTN基因還能參與糖代謝、脂肪代謝、骨密度調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程，從而推斷該基因與運(yùn)動(dòng)能力存在必然的聯(lián)系[32-33]，而通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)這項(xiàng)技術(shù)則為日后開(kāi)發(fā)運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)的基因與研究提供重要的科學(xué)依據(jù)。

3.2提供表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)

20世紀(jì)末Adams[20]等提出了表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tags，ESTs)的概念即：從cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選單克隆，從5’末端或3’末端對(duì)所插入的片段進(jìn)行單向測(cè)序，所獲得的一段60～500 bp的cDNA序列信息稱(chēng)為ESTs[34]。每條EST均代表該組織或細(xì)胞特定發(fā)育時(shí)期和生理狀態(tài)下的相關(guān)的遺傳信息。近年來(lái)，隨著公共數(shù)據(jù)庫(kù)中ESTs信息的完善，目前90％以上已注釋的基因都能在ESTs庫(kù)中獲得[35]。獲取的ESTs可用生物信息學(xué)方法進(jìn)行處理并與各公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比較，從而迅速準(zhǔn)確地確定基因位置與功能。由于在構(gòu)建cDNA文庫(kù)時(shí)盡可能地保證了cDNA的完整性，所以一旦篩選出有價(jià)值的ESTs，就可以找到對(duì)應(yīng)的克隆，獲得全長(zhǎng)cDNA并直接用于相關(guān)研究。最初階段，有關(guān)ESTs研究方向主要集中在物理圖譜的構(gòu)建，新基因的發(fā)現(xiàn)和特異組織的表達(dá)譜的研究，時(shí)至今日，隨著ESTs研究的不斷深入，該技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于比較基因組學(xué)，功能基因組學(xué)和疾病基因組學(xué)等新興領(lǐng)域當(dāng)中，為人類(lèi)更為深入的研究生物體生長(zhǎng)發(fā)育，衰老，死亡生命過(guò)程的本質(zhì)[36]提供重要的科學(xué)依據(jù)。

3.3為RNA-Seq提供基礎(chǔ)

mRNA作為DNA與蛋白質(zhì)之間信息傳遞的一個(gè)“橋梁”，所有表達(dá)基因的信息以及其轉(zhuǎn)錄水平，綜合起來(lái)被稱(chēng)作轉(zhuǎn)錄組[37]。隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)成為率先發(fā)展起來(lái)以及應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，轉(zhuǎn)錄組研究更能夠從整體水平研究基因結(jié)構(gòu)與功能，揭示生物學(xué)過(guò)程的分子機(jī)制。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的興起，RNA–Seq作為一種新的高效、快捷的研究手段正在改變著人們對(duì)這一領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)。RNA–Seq的應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛，例如：2008年Sultan[38]利用深度測(cè)序?qū)θ祟?lèi)細(xì)胞系mRNA剪接進(jìn)行了全局性研究，鑒定出9 424個(gè)剪接位點(diǎn)， 從中發(fā)現(xiàn)4 096個(gè)全新轉(zhuǎn)錄本。此外，RNA–Seq不僅可以檢測(cè)未知或稀有的轉(zhuǎn)錄本，同時(shí)還可對(duì)基因表達(dá)的差異進(jìn)行研究，Marioni等[39]研究人員利用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)肝臟和腎臟RNA樣品進(jìn)行測(cè)序，并與相同RNA樣品的芯片結(jié)果比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率的情況下，RNA–Seq比芯片技術(shù)多檢測(cè)出30％的差異表達(dá)基因，此外研究結(jié)果還表明，Illumina的測(cè)序數(shù)據(jù)具有高度的重復(fù)性，技術(shù)變化相對(duì)較小。不僅如此，利用新一代高通量測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)除了可以進(jìn)行以上基因注釋中常見(jiàn)的GO–KEGG和COG分析外，還可以進(jìn)行大量的其他生物信息學(xué)分析，以及開(kāi)發(fā)SNPs和SSR等[40]，而作為RNA–Seq的基礎(chǔ)，構(gòu)建cDNA文庫(kù)則成為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的重要技術(shù)手段。

3.4獲得全長(zhǎng)cDNA克隆

cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplifi cation of cDNA ends ， RACE)是1988年由Frohman等人發(fā)明的一項(xiàng)新技術(shù)，其原理是利用cDNA部分已知序列通過(guò)PCR擴(kuò)增得到完整的cDNA的一種技術(shù)手段，該技術(shù)可以根據(jù)克隆mRNA的位置分為cDNA3’末端快速擴(kuò)增(3’–end amplifi cation of cDNAs 3’RACE)和cDNA5’末端快速擴(kuò)增(5’–end amplifi cation of cDNAs，5’RACE)。5’RACE 技術(shù)和3’RACE技術(shù)有時(shí)也結(jié)合起來(lái)用于克隆全長(zhǎng)mRNA[41]。隨著RACE技術(shù)的日益完善，通過(guò)此項(xiàng)技術(shù)不僅可以從文庫(kù)中得到完整的基因序列，而且還可用于制備篩選cDNA文庫(kù)的探針、克隆已知片段的旁側(cè)序列、分離調(diào)控元件或被選擇性剪接特殊轉(zhuǎn)錄物等。近年來(lái)通過(guò)科學(xué)家們對(duì)該技術(shù)的不斷完善[42]，使得該方法與其他技術(shù)相結(jié)合，例如抗體技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)等等，使其在新的領(lǐng)域也得到發(fā)展。

4　結(jié)語(yǔ)

隨著科技的進(jìn)步cDNA文庫(kù)的構(gòu)建技術(shù)以日趨成熟，并在農(nóng)業(yè)、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域已取得了一批珍貴的研究成果，但在體育領(lǐng)域至今仍無(wú)人問(wèn)津，而通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)不僅可有效保存優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員遺傳資源和分離全長(zhǎng)功能基因，并可從轉(zhuǎn)錄水平反映運(yùn)動(dòng)員特定時(shí)期功能基因在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老等生命現(xiàn)象的研究過(guò)程中所起到的重要作用，從而為運(yùn)動(dòng)員科學(xué)選材、制定合理訓(xùn)練計(jì)劃、篩選運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)基因及運(yùn)動(dòng)遺傳資源的保存等方面提供可行性依據(jù)和理論指導(dǎo)。

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Potential Value and Prospect of Applying the Construction Technology of Full-length cDNA Library in Sport Genetic Resource Development

ZHANG Ze-biao1，2， ZHAO Yu-hua1， ZHOU Wen-ting1， ZHAO Chen-qiong1，ZHANG Ying1， ZHU Zhi-qiang1， GUAN Wei-jun2
（1.Harbin Sport University， Harbin 150008， China； 2.Beijing Research Institute of Animal Husbandry Veterinary，Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

With the completion of Human Genome Project (HGP)， people have a new understanding of their own genetic information. There are various expression levels of genes under different conditions，which result in the different of individual physiological phenotype and function. With the rapid development of sequencing technology， it has become an important technique for current researcher in transcription study to construct the full-length cDNA library in high-quality. With the method of literature，the paper fi nds out that there are four methods of full-length cDNA library construction which are more mature and which usages are more general， but which mention is not so far in sports science. It describes in detail several construct methods and characteristics of full-length cDNA library which techniques are mature in recent years， and has an overview of their applications. It thinks their techniques have same potential application value in sports science. If the methods be used in developing the athletes genetic resources， it will play an unprecedented impact on the development of sports science.

elite athlete； full-length cDNA library； genetic resources； application value

G804.2

A

1002–3488(2016)02–0041–08

2016–01–29；

2016–02–05

張澤彪(1990–)，男，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)分子生物學(xué)。

朱志強(qiáng)(1960–)，男，黑龍江佳木斯人，博士，教授，國(guó)家體育總局冰雪運(yùn)動(dòng)基礎(chǔ)理論與訓(xùn)練方法重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，研究方向?yàn)楸┻\(yùn)動(dòng)基礎(chǔ)理論與訓(xùn)練方法。