快速溶劑萃取-HPLC法測定骨碎補中柚皮苷的含量

黃北雄，戴柏桉（廣西梧州食品藥品檢驗所，廣西梧州　543002）

快速溶劑萃取-HPLC法測定骨碎補中柚皮苷的含量

黃北雄＊，戴柏桉（廣西梧州食品藥品檢驗所，廣西梧州543002）

目的：為骨碎補中柚皮苷的提取及測定開辟新的途徑。方法：采用ASE350型快速溶劑萃取系統提取骨碎補中的柚皮苷；以高效液相色譜法測定骨碎補中柚皮苷的含量。色譜柱為Kinetex XB-C18，流動相為甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V），流速為0.8 ml/min，檢測波長為283 nm，柱溫為40℃，進樣量為10μl。結果：柚皮苷的進樣量線性范圍為0.073 0～0.730 0μg（r=0.999 9））；定量限為0.73 μg，檢測限為0.022 μg；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2%；加樣回收率為98.92%～100.85%（RSD=0.72%，n=6）。結論：該方法簡便、準確、專屬性強，可用于測定骨碎補中柚皮苷的含量。

高效液相色譜法；骨碎補；柚皮苷；快速溶劑萃取

骨碎補為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J. Sm.的干燥根莖，氣微、味淡、微澀，有療傷止痛、補腎強骨、外用消風祛斑的功效，可用于跌撲閃挫、筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨痿軟、耳鳴耳聾、牙齒松動、外治斑禿、白癜風等的治療［1］。現代藥理研究也表明骨碎補具有降血脂、降低胺基糖苷類抗生素的毒性和促進骨吸收等作用［2］。柚皮苷是骨碎補的主要有效成分之一，2015年版《中國藥典》（一部）以柚皮苷作為其質量評價的指標。目前，骨碎補中柚皮苷的提取主要有煎煮法、加熱回流法、索氏提取法［3-4］、超聲萃取法、微波輔助萃取法［5-8］，測定方法有高效液相色譜法（HPLC）［9-11］和薄層-紫外分光光度法［12-13］，但是上述方法提取時間長、測定步驟煩瑣。因此，筆者利用美國Dionex公司的快速溶劑萃取系統對樣品進行提取，縮短提取時間、提高效率，并采用HPLC法測定骨碎補中柚皮苷的含量，以期為骨碎補中柚皮苷的提取及測定開辟新的途徑。

1　材料

1.1儀器

ASE350型快速溶劑萃取儀（美國Dionex公司）；Ultimate 3000 DGLC型HPLC儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；XA205DU型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2試劑

柚皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：200001，純度：94.7%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3藥材

骨碎補（玉林市康華中藥飲片有限公司，批號：131206；廣西玉林市祥生中藥飲片有限責任公司，批號：140601；玉林市華濟中藥飲片有限公司；批號：14070301）經廣西梧州食品藥品檢驗所葉小強藥師鑒定為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortune（Kunze）J.Sm.的干燥根莖。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：Kinetex XB-C18（100 mm×4.6 mm，2.6 mm）；流動相：甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V）；流速：0.8 ml/min；檢測波長：283 nm；柱溫：40℃；進樣量：10μl。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液精密稱取柚皮苷對照品適量，置于25 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含柚皮苷36.5 μg的對照品溶液。

2.2.2供試品溶液取樣品粗粉0.1 g，按1∶1的比例加入硅藻土后混勻，裝于10 ml萃取池中，再用硅藻土填滿萃取池，在ASE350型快速溶劑萃取儀控制面板編程進行萃取試驗（萃取壓力為1 700 psi，溶劑為甲醇，萃取溫度為120℃，循環次數為2次，萃取時間為5 min，沖洗體積為100%）。萃取結束后，將萃取液轉移至50 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5；理論板數以柚皮苷峰計為5 000；保留時間為5.73 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1　高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；1.柚皮苷Fig 1　HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；1.naringin

2.4快速萃取條件的確定

2.4.1靜態萃取溫度平行取樣品粗粉適量，共5份，按1∶1的比例加入硅藻土后混勻，裝于10 ml萃取池中，用硅藻土填滿萃取池，參考2015年版《中國藥典》（一部）“骨碎補含量測定項下”水浴的溫度，分別設定提取溫度為80、100、120、140、160℃進行提取，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算柚皮苷的含量。結果，120℃時柚皮苷的提取量最高，超過120℃以后柚皮苷的提取量呈遞減趨勢，同時色譜圖中未知雜質成分增多。因此，本試驗選擇120℃為提取溫度。

2.4.2循環次數平行取樣品粗粉適量，共3份，按1∶1的比例加入硅藻土后混勻，裝于10 ml萃取池中，用硅藻土填滿萃取池，分別設定循環次數為1、2、3次進行提取，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算柚皮苷的含量。結果，循環次數為2次和3次時柚皮苷的提取量最高。為節約提取時間，故本試驗的循環次數選擇2次。

2.4.3靜態萃取時間平行取樣品粗粉適量，共4份，按1∶1的比例加入硅藻土后混勻，裝于10 ml萃取池中，用硅藻土填滿萃取池，分別設定靜態萃取時間為3、5、7、9 min進行提取，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算柚皮苷的含量。結果，提取時間為5、7、9 min時，柚皮苷的含量最高。為節約試驗時間，故本試驗選擇靜態萃取時間為5 min。

2.4.4沖洗體積平行取樣品粗粉適量，共6份，按1∶1的比例加入硅藻土后混勻，裝于10 ml萃取池中，用硅藻土填滿萃取池，分別設定沖洗體積為0、40%、80%、100%、120%、150%進行提取，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定并計算柚皮苷的含量。結果，沖洗體積為100%、120%、150%時柚皮苷的含量最高。為節約試驗成本，故本試驗沖洗體積選擇為100%。

2.5線性關系考察

分別精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液0、2、5、10、15、20 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得柚皮苷的回歸方程為y=1 888.8x+8.980 5（r=0.999 9）。結果表明，柚皮苷的進樣量線性范圍為0.073 0～0.730 0μg。

2.6定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得柚皮苷的定量限為0.73 μg；當信噪比為3∶1時，得柚皮苷的檢測限為0.022 μg。

2.7精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，柚皮苷峰面積的RSD=0.04%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，柚皮苷峰面積的RSD=0.99%（n=7），表明供試品溶液在室溫下12 h內穩定性良好。

2.9重復性試驗

取樣品（批號：131206）粗粉適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，柚皮苷峰面積的RSD=1.47%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.10加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：131206）粗粉適量，共6份，每份0.05 g，精密稱定，分別精密加入一定質量的柚皮苷對照品，按“2.2.2”項下方法制備6份供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果詳見表1。

表1　加樣回收率試驗結果（n=6）Tab 1　Results of recovery test（n=6）

2.11樣品含量測定

取3批樣品粗粉適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算柚皮苷的含量，結果詳見表2。

表2　樣品含量測定結果（n=3）Tab 2　Results of content determination of samples（n=3）

3　討論

本試驗比較了甲醇-乙酸-水（35∶4∶65，V/V/V）、甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V）兩種不同比例的流動相，通過預試驗表明，甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V）為流動相時，柚皮苷峰與相鄰色譜峰的分離效果較好、峰型較好。故本試驗選擇甲醇-5%乙酸（25∶75，V/V）為流動相。

綜上所述，本方法簡便、準確、專屬性強，可用于測定骨碎補中柚皮苷的含量。

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［5］方婧，楊洪軍，付梅紅，等.微波協助提取在中藥飲片含量測定中的應用（4）：微波法與藥典法測定骨碎補中柚皮苷含量比較［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（6）：75.

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［7］李園園，石磊，張振巍，等.混合均勻設計結合響應面法優選枳苓六妙口服液中藥材的提取工藝［J］.中國藥房，2013，24（39）：3 685.

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［9］張紅旭，郭輝.HPLC法測定骨碎補酊中柚皮苷含量［J］.西北藥學雜志，2006，21（2）63.

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［13］陳潔.薄層-紫外分光光度法測定骨碎補中柚皮甙的含量［J］.中醫正骨雜志，2007，19（3）：76.

（編輯：劉柳）

Determination of Naringin in Davallia mariesii byAccelerated Solvent Extration-HPLC

HUANG Beixiong，DAI Baian（Guangxi Wuzhou Institute for Food and Drug Control，Guangxi Wuzhou 543002，China）

OBJECTIVE：To develop a new way for the extration and determination of naringin in Davallia mariesii.METHODS：Naringin in D.mariesii was extracted by ASE350 accelerated solvent extraction system；HPLC was performed for the content determination of naringin in D.mariesii，the column was Kinetex XB-C18with mobile phase of methanol-5%acetic acid（25∶75，V/V）at a flow rate of 0.8 ml/min，detection wavelength was 283 nm，column temperature was 40℃，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range of naringin was 0.073 0-0.730 0μg（r=0.999 9）；the limit of quantitation was 0.73 μg，the limit of detection was 0.022 μg；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recovery was 98.92%-100.85%（RSD=0.72%，n=6）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and specific，and can be used for the content determination of naringin in D.Mariesii.

HPLC；Davallia mariesii；Naringin；Accelerated solvent extraction

R917

A

1001-0408（2016）27-3875-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.44

＊副主任藥師。研究方向：食品藥品檢驗。電話：0774-3886969。E-mail：392271494@qq.com

（2015-12-19

2016-07-16）