硫酸鹽還原菌對煤系地下水水質的影響

劉 碩,葛曉光,漆 春,趙廣秀

(合肥工業大學 資源與環境工程學院,安徽 合肥 230009)

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硫酸鹽還原菌對煤系地下水水質的影響

劉 碩,葛曉光,漆 春,趙廣秀

(合肥工業大學 資源與環境工程學院,安徽 合肥 230009)

我國黃淮平原地區的煤田中,礦井井下揭露的地下水礦化度多在2～4 g/L,優勢離子一般為SO42-,但有些礦井充水地層SO42-含量卻很低。SO42-含量低的潘北礦煤系地下水中含有硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB),地下水在SRB作用下能發生脫硫酸作用。文章以實驗的方法研究發現SRB能利用煤作為碳源,使地下水水質發生變化。脫硫酸作用后礦井水pH值升高,礦化度降低,硬度降低,SO42-、Ca2+及Mg2+質量濃度降低,CO32-和HCO3-質量濃度升高,Cl-、Na+、K+質量濃度不變。

硫酸鹽還原菌;硫酸鹽;脫硫酸作用;地下水;水質

在我國黃淮平原地區的煤田中,礦井井下揭露的地下水礦化度多在2～4 g/L,優勢離子一般為SO42-[1]。但有些礦井充水地層SO42-含量卻很低,如淮南礦區的潘北礦。這種SO42-低值異常現象與通常的水文地質化學規律相悖[2]。脫硫酸作用是一項基本的水文地球化學作用[3],通常發生在含有機質的還原環境中,該作用是由硫酸鹽還原細菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)導致的[4-6]。已有相關研究證實這類地下水中存在硫酸鹽還原菌[2,5,7-8],雖然證實了煤系地下水可發生脫硫酸作用[9],但是對該作用對煤系地下水水質影響的研究并不深入。本文以實驗的方法,選取SO42-含量異常的潘北礦礦井水作為菌種來源,研究硫酸鹽還原菌對SO42-含量正常的濉肖礦區劉橋二礦礦井水水質的改變,以確認造成兩礦礦井水水質差異的部分原因為脫硫酸作用。

1 實驗材料與方法

1.1 樣品采集

菌樣取自淮南礦區潘北礦-490 m深井,終孔層位在石炭系太原組,水溫38.4 ℃,水質為Na-Cl·HCO3-型,水略有臭味。用2個滅菌后的500 mL磨口玻璃瓶接取鉆孔水,充滿后蓋緊瓶塞,用PTEE膠帶纏封瓶口,通過便攜式保溫箱攜帶,當天送往實驗室,4 ℃保存備用。

水樣取自濉肖礦區劉橋二礦-650 m深井,終孔層位在二疊系煤系砂巖含水層,水溫39.2 ℃,水質為Ca-SO42-型。煤樣取自劉橋二礦下二疊系山西組煤層,取樣方法為刻槽法,煤樣所在層位距離水樣所在含水層法向距離約15 m。

1.2 實驗過程

將含菌礦井水取5 mL接種進Postgate B[10]培養基中,放入恒溫培養箱(SKP-01B型)40 ℃厭氧培養5 d。采用平皿壓層厭氧法[11],用Postgate E[10]培養基進行細菌的分離。用Postgate C[10]培養基進行細菌的擴大繁殖。如此反復進行3次分離純化,可得到1株較純菌株,命名為S890。

本實驗的培養裝置采用容積為500 mL的磨口錐形瓶,設置3個平行對照組,編號為A、B、C組。將所取煤樣放入干燥箱(DHG-9010-2SA型)在110 ℃下干燥5 h。磨成粉末(JP-150A-8粉碎機),過200目篩[1],稱取20 g,用聚丙烯無紡布包裹3層,用自鎖式尼龍扎帶捆扎,將包好的煤樣放入錐形瓶中。取500 mL水樣放入錐形瓶內,用紗布密封瓶口。將密封好的錐形瓶和瓶塞放入滅菌器(YXQ.SG41.280手提式)在0.15 MPa下高溫滅菌30 min[12],待錐形瓶冷卻后去掉密封的紗布,在瓶塞處涂抹凡士林,蓋上瓶塞,放入無菌操作箱浸泡煤粉2 h。浸泡后加入1 g FeCl2粉末,放入超聲波清洗器(KQ-300DE型)中加速溶解,溶解后接種[12]2 mL純化后的菌種。接種后以200～300 mL/min的流量通入高純氮(99.99%)置換培養基中的溶解氧(dissolved oxygen,DO),直到DO(AZ-8403溶氧儀)值小于0.2 mg/L后密封。密封時在瓶口處涂抹凡士林,保證良好的密封性,密封后放入培養箱(SKP-01B型)內培養。

每天測量培養液的pH值(AZ8686pH筆)、氧化還原電位(oxidation-reduction potential,ORP)(CL200筆式ORP計)和各離子質量濃度(包括SO42-、硫化物、Cl-、Na+、K+、Ca2+、Mg2+)。由于測CO32-和HCO3-質量濃度取樣量較大,所以只在第1天和第5天測量。pH值、ORP的測量和取樣過程均在有機玻璃真空手套箱中進行以保證厭氧環境。

第5天將3組錐形瓶用漩渦混合器進行震蕩,待固液混合均勻每瓶抽取50 mL溶液分裝到5個10 mL的離心管中,以5 000 r/min離心5 min(DM0412離心機),去清后取得固體沉淀。離心后每組取其中1管沉淀直接冷凍干燥[13]48 h(FD-1C-50冷凍干燥機),做X射線光電子能譜分析(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)(ESCALAB25型X射線光電子能譜儀,美國Thermo);再將1管沉淀冷凍干燥48 h,進行掃描電子顯微鏡分析(scanning electron microscope,SEM)(SU8020場發射掃描電子顯微鏡,日本Hitachi);將剩余的3管沉淀固定、脫水、冷凍干燥[14-15]后進行SEM分析。做SEM時固體樣品處理方法不同是因為對細菌做掃描電鏡必須進行固定、脫水。

離子成分定量分析:SO42-和Cl-質量濃度用離子色譜法測量(IC6200型離子色譜儀);硫化物質量濃度用亞甲基藍分光光度法測量[16-17];CO32-和HCO3-質量濃度用鹽酸滴定法測量[18];陽離子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+)質量濃度用電感耦合等離子體發射光譜儀(Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry,ICP-OES)(PQ900,德國耶拿)測量。

2 實驗結果與分析

2.1 細菌檢測結果分析

將新采集的潘北礦礦井水和培養結束后的培養液冷藏保存寄往上海生物工程公司進行高通量基因測序,從而確定細菌種屬并分類。

潘北礦礦井水細菌按門分類結果見表1所列,其中變形菌門細分到綱。

表1 細菌群落在門分類水平的細菌組成

提取DNA后,使用細菌的16S rRNA通用引物對所提取DNA進行聚合鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增,擴增區域為細菌的V3—V4區。PCR所用的引物已經融合了Miseq測序平臺的通用引物。PCR結束后,對PCR產物進行瓊脂糖電泳,采用生工瓊脂糖回收試劑盒(cat:SK8131)對DNA進行回收。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量,利用Miseq測序平臺進行基因測序。經 PCR擴增和基因測序后,將獲得的基因序列在GenBank DNA 數據庫中進行BLAST對比,確定細菌的種屬并分類[19-23]。

將實驗第5天所采集菌樣的檢測結果在NCBI網站進行BLAST相似性檢測,比對GenBankDNA序列數據庫,進行同源分析,選取一批與該菌株同源性高的菌株序列,應用MEGA5.1軟件中的NJ法建立系統發育樹,如圖1所示。

圖1 菌株S890和相關菌的基因序列系統發育樹

檢測結果表明,煤系地下水中細菌種類非常豐富,其中變形菌約占總數的87%。變形菌中α變形菌約占9%；β變形菌約占16.4%；γ變形菌約占19%；δ變形菌約占5.21%,ε變形菌約占37.39%。

其中δ變形菌中的Desulfovibrio屬于SRB類,約占細菌總數的4%。

分離提純培養后的S890的基因序列為:

GGGGAATATTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGAAGGTCCTCGGATCGTA

AACCTCTGTCAGGAGGGAAGAACCGCCACGGTGCTAATCAGCCGTGGTCTGACGGTACCTCCAAAGGAAGCA

CCGGCTAACCCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATCACTGGGCGTAAA

GCGCACGTAGGCTGCTTGGTAAGTCAGGGGTGAAAGCCCGCGGCTCAACCGAGGAATTGCCTTTGATACTGC

CGAGCTAGAGTCCGGGAGA GGGTAGTGGAATTCCAGGTGTAGGAGTGAAATCCGTAGAGAGCTGGAGGAA

CATCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACCGGTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACA。

從基因發育樹可以看出,菌株S890與Desulfovibriopigro及Desulfovibriopiger序列的吻合度最高,因此S890應屬于脫硫弧菌屬Desulfovibriosp.。

2.2 XPS結果分析

對第5天處理后的3組固體沉淀充分混合后進行XPS分析,得到了針對S元素的S2p結合能-豐度關系譜圖。S元素的結合能-豐度譜圖用XPSPEAK4.1分峰軟件進行分峰,分峰結果如圖3所示。圖3中FeS在161.2 eV處成峰;SO42-在168.5 eV處成峰[24-25]。從分峰結果可以看出S元素主要以FeS和SO42-形式存在,固體沉淀中FeS占優。

圖2 S元素結合能-豐度譜圖

2.3 SEM結果分析

將第5天處理所得2類固體樣品噴金做掃描電鏡。掃描電鏡照片如圖3所示,圖3中，細菌大多為短弧狀,大小在(0.4～0.8 μm)×(1.5～2.0 μm),固體成分為絮狀膠體,未看到結晶。

圖3 掃描電鏡照片

2.4 離子成分變化結果分析

將每天所測離子成分繪制成Piper三線圖,如圖4所示。其中第2～4天的HCO3-和CO32-質量濃度采用內插法計算求得。從圖4可以看出在培養過程中Na++K+質量濃度穩定;Ca2+和Mg2+質量濃度降低;Cl-質量濃度較穩定;HCO3-和CO32-質量濃度升高;SO42-質量濃度大幅降低。硫化物質量濃度升高,多以沉淀形式存在,其質量濃度隨時間變化如圖5所示。

圖4 離子Piper三線圖

圖5 硫化物質量濃度隨時間的變化

2.5 pH值和ORP結果分析

在整個培養過程中每天測量pH值和ORP,測量結果繪制成折線圖,如圖6所示。從圖6可以看出,整個過程pH值升高,最高可達8.9;ORP降低,最低達到了-460 mV。

圖6 pH值、ORP隨時間變化曲線

3 結果討論

硫酸鹽還原細菌(SRB)是一類形象和營養多樣化、利用硫酸鹽作為有機物異化作用電子受體的兼性厭氧微生物。SRB會將硫酸鹽還原為硫化物,并產生CO2和OH-。反應過程[26-27]如圖7所示。

圖7 硫酸鹽還原反應過程

這個過程是在厭氧條件下強酸鹽變為了弱酸鹽,并產生了OH-,所以培養基pH值升高。細菌在分解代謝過程中消耗了SO42-和碳源,生成了S2-和CO2。

培養基pH值升高,會破壞水中的碳酸平衡,當pH>8.34時HCO3-會轉化為CO32-,水中的Ca2+和Mg2+會使之沉淀,導致Ca2+、Mg2+、CO32-、HCO3-質量濃度降低。由于細菌的分解代謝作用,將碳源分解生成了CO2,且生成量遠多余于CO32-、HCO3-的沉淀量,所以最后溶液中CO32-、HCO3-質量濃度升高。細菌代謝消耗了SO42-,產生的CO32-、HCO3-和S2-會被Ca2+、Mg2+和重金屬離子沉淀,所以總礦化度降低。Ca2+、Mg2+質量濃度降低使水的硬度降低。

脫硫酸作用的還原產物主要以FeS形式存在,在40 ℃時FeS在pH值為 6.5～12.5,Eh(ORP)為-300～-700 mV時穩定,如圖8所示[28-32]。

圖8 40 ℃時Fe-S系統Eh-pH圖

將所得結果與礦井地下水水質資料結合分析可知:封閉性較好的煤系地層,地下水處于還原環境,有利于SRB生存,這些礦井一般SO42-質量濃度較低,CO32-、HCO3-質量濃度相對較高,Ca2+、Mg2+質量濃度相對較低;封閉條件較差的礦井,地下水還原環境不好,不利于SRB生存,這些礦井一般SO42-質量濃度較高,CO32-、HCO3-質量濃度相對較低,Ca2+、Mg2+質量濃度相對較高。地下水水質資料見表2所列[1]。

表2 各礦井地下水水質情況 mg/m3

4 結 論

基因檢測結果表明，還原環境較好的潘北煤礦煤系地下水中細菌種類豐富,存在硫酸鹽還原菌。硫酸鹽還原菌能利用煤粉浸出液作為碳源,利用礦井水作為反應底物,且作用后會使環境的氧化還原電位降低,形成還原環境。

在硫酸鹽還原菌作用下煤系地下水的水質發生變化:pH值升高,SO42-、Ca2+及Mg2+質量濃度降低,CO32-、HCO3-質量濃度升高,總礦化度降低,硬度降低。

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(責任編輯 張淑艷)

Effect of sulfate-reducing bacteria on groundwater quality in coal measures

LIU Shuo,GE Xiaoguang,QI Chun,ZHAO Guangxiu

(School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

In the coal mine of Huang-Huai Plain in China, the groundwater salinity of underground mine is mostly at 2-4 g/L, and the advantage ion is SO42-generally. But the content of SO42-at some water filling formations is very low. There are sulfate-reducing bacteria(SRB) in the groundwater of Panbei coal mine with low content of SO42-. Desulfurization can occur under the action of SRB. In this paper, it was found that SRB could use coal as carbon source to change the groundwater quality. After the desulfurization, the pH value increased, the salinity, water hardness and the content of SO42-, Ca2+and Mg2+decreased, the content of CO32-and HCO3-increased, and the content of Cl-, Na+and K+was unchanged.

sulfate-reducing bacteria(SRB); sulfate; desulfurization; groundwater; water quality

2015-06-10；

2015-07-06

國家自然科學基金資助項目(41172216)

劉 碩(1989-),女,河北保定人,合肥工業大學碩士生;

葛曉光(1956-),男,安徽淮南人,博士,合肥工業大學教授,碩士生導師.

10.3969/j.issn.1003-5060.2016.10.021

P641.11

A

1003-5060(2016)10-1401-06