速效救心丸對大鼠血小板聚集率及環磷腺苷水平的影響

李益萍，羅良國，沈 磊，王肖龍

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速效救心丸對大鼠血小板聚集率及環磷腺苷水平的影響

李益萍1，羅良國2，沈 磊2，王肖龍1

目的 探討速效救心丸對血小板聚集的作用及機制。方法 采用比濁法測定速效救心丸、阿司匹林、阿魏酸哌嗪對二磷酸腺苷(ADP)、膠原和花生四烯酸(AA)誘導的大鼠血小板聚集率和環磷腺苷(cAMP)水平的影響。結果 與空白組比較，速效救心丸中、高劑量組可顯著抑制ADP、膠原、AA誘導大鼠的血小板聚集(P<0.01)；速效救心丸高劑量組對AA誘導的大鼠血小板聚集抑制作用較阿司匹林組好；速效救心丸可提高大鼠血小板內cAMP的含量(P<0.05)。結論 速效救心丸能夠抑制大鼠ADP、膠原和AA誘導的血小板聚集，其機制可能通過增加cAMP的含量而發揮作用。

速效救心丸；血小板聚集；環磷腺苷；阿司匹林

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)是嚴重危害人類健康的常見病。血栓形成在CHD的發生發展中具有重要作用。 冠脈斑塊破裂可引起血小板聚集，繼發性血栓形成，致使血管阻塞和相關區域心肌缺血或壞死[1]。同時，冠脈介入治療導致的內皮損傷，也可引起血小板激活，支架內血栓形成，為冠脈介入術后并發癥。因此，運用抗血小板聚集藥物是CHD或冠脈介入術后重要的治療措施。然而，目前臨床上常用的抗血小板藥物如阿司匹林、氯吡格雷等因其不良反應或藥物抵抗等，一定程度上影響了其臨床運用及有效性。

因此，積極開展活血中藥的抗血小板機制研究具有潛在的臨床價值。

速效救心丸是治療冠心病、心絞痛的常用藥，具有行氣活血，祛瘀止痛的作用。速效救心丸主要由川芎、冰片等組成，其有效成分或衍生物可抑制血小板聚集[2-4]。但速效救心丸對血小板功能的影響至今未見詳細報道。本研究通過測定速效救心丸對血小板最大聚集率和血小板內環磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)含量的影響，探討速效救心丸對血小板聚集的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級別 Wistar雄性大鼠，280 g～320 g，北京維通利華有限公司動物養殖中心提供，所有大鼠分籠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心。

1.1.2 藥物和試劑 生理鹽水、速效救心丸(天津中新藥業集團股份有限公司第六中藥廠生產，批號Z12020025)、阿司匹林(拜耳醫藥保健公司，批號13527270)、阿魏酸哌嗪片(成都亨達藥業有限公司，批號151001)；二磷酸腺苷(ADP)、膠原、BSA、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氯化鎂，花生四烯酸(AA)，EGTA，其他生化試劑均為國產分析純；大鼠cAMP ELISA試劑盒(上海普盛生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器和器材 Mettler-Toledc電子天平(上海梅特勒-托儀多公司)；TYXN-96多功能智能血液凝聚儀(上海通用)；Labsystems Multiskan MS Microplate Reader型酶標儀(芬蘭制造)；Bio-RAD TC-20細胞計數儀(日本 Sysmex公司)；渦旋振蕩器 votex-2(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；eppendorf Centrifuge 5430R型離心機(德國eppendorf)；Beckman coulter離心機(美國貝克曼)；15 mL 硅化離心管(corning)；10 mL無菌注射器(上海康萊德企業發展集團股份有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠灌胃 Wistar大鼠36只(280 g～330 g)，據體重和隨機數字表完全隨機區組分組，分為6組，按人-動物藥物劑量換算表予空白組(生理鹽水2 mL)、阿司匹林組(20 mg/kg)、速效救心丸救心丸高劑量組(120 mg/kg)、速效救心丸中劑量組(60 mg/kg)、速效救心丸低劑量組(30 mg/kg)、阿魏酸哌嗪組(60 mg/kg)，灌胃7 d，最后一次灌胃半小時后取血。

1.2.2 大鼠腹主動脈取血 Wistar大鼠行3%戊巴比妥稱定質量麻醉，剪開皮膚肌肉，找到腹主動脈，3.8%枸櫞酸鈉潤洗的 10 mL 注射器，以腹主動分叉處向心端1 mm～3 mm處穿刺取血，取血后3.8%枸櫞酸鈉1∶9抗凝。

1.2.3 血小板的制備 取血后配平離心(1 000 r/min，8 min)取上清，為富血小板血漿(PRP)，其余血離心(3 000 r/min，15 min)取上清為貧血小板血漿(PPP)。

1.2.4 洗滌血小板的制備 PRP離心(2 500 r/min，10 min)，棄上清用改良臺式緩沖液洗滌兩次后定容吹打開(600 g，10 min)[5]，獲得血小板懸浮液，經細胞計數儀使血小板計數調至4.5×108/mL。

1.2.5 加入不同誘導劑測血小板聚集率 采用比濁法在37℃條件下測定血小板聚集率。取 200 μLPRP， 分別加入 ADP(終濃度：15 μM)、膠原(終濃度：0.325 mg/mL)、AA(終濃度：0.05 mM)。血小板聚集率用血小板最大聚集率表示，結果用抑制率表示。 抑制率(%)=(空白組血小板聚集率—受試物處理組血小板聚集率)/空白組血小板聚集率×100%

1.2.6 血小板內cAMP含量測定 血小板懸液加入 ADP(終濃度：20 μM)誘導血小板聚集。5 min 后，加入 10 mM EDTA 終止反應，4 000 r/min，4℃離心 10 min，收集上清液。 -20℃凍存。cAMP 含量測定按照試劑盒說明書進行。

1.3 統計學處理 組間比較使用單因素方差分析。P<0.05表示有統計學意義，P<0.01表示具有顯著差異。應用SPSS18.0軟件進行統計分析，作圖使用GraphPad Prism6.07軟件。

2 結 果

2.1 各誘導劑對不同藥物干預后大鼠血小板聚集率的影響 ADP誘導的血小板聚集率：速效高劑量組、阿魏酸哌嗪組與空白組比較有統計學意義(P<0.01)，并呈一定的量效關系趨勢。膠原誘導的血小板聚集率：阿司匹林組、速效中高低劑量組、阿魏酸組與空白組比有統計學意義(P<0.01)。AA誘導的血小板聚集率：阿司匹林組、速效高劑量組、阿魏酸哌嗪組與空白組比有統計學意義(P<0.01)；速效低劑量組與速效高劑量組比有統計學意義(P<0.01)；速效中劑量組與速效高劑量組比較無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各誘導劑對不同藥物干預后大鼠的血小板聚集影響(±s)

2.2 各誘導劑對不同藥物干預后大鼠血小板抑制率的影響(見圖1) 阿司匹林組、速效高劑量組、速效中劑量組、速效低劑量組、阿魏酸哌嗪組對ADP誘導的大鼠血小板聚集的抑制率依次為9.05%、32.87%、11.84%、2.17%、27.55%；對膠原誘導的大鼠血小板聚集的抑制率依次為55.03%、30.31%、30.97%、21.89%、34.21%；對AA誘導的大鼠血小板聚集的抑制率依次為60.07%、72.42%、62.73%、10.86%、66.41%。阿司匹林對AA和膠原誘導的血小板聚集有較大的抑制作用，對ADP誘導的血小板聚集抑制作用較弱；高劑量速效救心丸及阿魏酸哌嗪對ADP、AA和膠原誘導的血小板聚集均有有較大的抑制作用；同時，速效救心丸對ADP、AA和膠原誘導的血小板聚集抑制率呈現一定的量效關系。

注：從左到右次序為阿司匹林組、速效救心丸高劑量組、速效救心丸中劑量組、速效救心丸低劑量組、阿魏酸哌嗪組。

圖1 不同誘導劑對不同藥物干預后血小板聚集抑制率的影響(n=6)

2.3 血小板內cAMP含量的測定(見圖2) 模型組與空白組比存在統計學意義(P<0.05)，說明造模成功。

注：SXH為速效救心丸高劑量組；SXM為速效中劑量組；SXL為速效低劑量組；FA為阿魏酸哌嗪組；Blank為空白組；Control為空白組+20 μM ADP；其余各組均加入20 μM ADP。與空白組比，*P<0.05； 與對照組比，#P<0.05，## P<0.01。

圖2 不同藥物對血小板內cAMP的影響(n=6)

3 討 論

冠脈斑塊的破裂或PCI術導致的血管內皮受損，血小板在血管損傷部位的活化聚集，進而形成血栓[6]。AA、ADP以及血管內皮下暴露的膠原等誘導劑在血小板活化和聚集過程中起著重要的作用。cAMP是調節血小板功能的抑制性細胞內第二信使，細胞內cAMP水平增加，可以抑制血小板聚集，反之，則血小板聚集作用增強。AA代謝生成的血栓素A2(TXA2)和致密顆粒中釋放的ADP與血小板表面相關受體結合，可使胞內cAMP濃度下降，引起血小板聚集，導致血栓形成[7-8]。目前臨床上常用的抗血小板藥物阿司匹林和P2Y12抑制劑氯吡格雷主要通過抑制AA和ADP途徑起到抗血小板聚集作用，并已成為冠心病二級預防以及冠脈介入術后基礎用藥[9]。然而，這些藥物的運用也存在一定的缺陷：不良反應較多(如出血、胃腸功能紊亂、變態反應、中毒反應、對肝腎的損害等)；由于多數藥物作用途徑單一，不能抑制其他血小板激活通路，可引起復發性缺血事件；部分病人會出現阿司匹林或/和氯吡格雷藥物抵抗[10-11]。因此，研制出高效、安全性好的抗血小板藥物一直是研究的熱點。

中醫藥具有多方位、多靶點的干預作用特點，活血化瘀中藥在臨床上應用廣泛并療效確切，對中醫藥抗血小板聚集作用的深入研究具有積極的臨床意義。

速效救心丸是臨床效果確切的治療冠心病經典中成藥，研究表明其具有血管擴張、抗炎、抗氧化、調脂及促進血管新生的作用[12]，但對血小板功能影響的報道較少。本研究發現：①中、高劑量速效救心丸能夠抑制大鼠ADP、膠原和AA誘導的血小板聚集，低劑量速效救心丸僅能抑制膠原誘導的血小板聚集。不同劑量的速效救心丸抗血小板聚集作用具有一定的量效關系。②與對照組相比，中、高劑量速效救心丸能夠提高大鼠血小板內cAMP的含量，而低劑量速效救心丸有增高血小板內cAMP含量的趨勢，且呈現一定的量效關系。提示速效救心丸可能通過cAMP途徑起到抗血小板聚集的作用。③阿司匹林能夠降低膠原和AA誘導的血小板聚集，但不能拮抗ADP誘導的血小板聚集。阿魏酸哌嗪能夠抑制大鼠ADP、膠原和AA誘導的血小板聚集，其抑制療效與高劑量速效救心丸相似，提示速效救心丸發揮抗血小板聚集作用可能與川芎的有效成分有關。阿司匹林與阿魏酸哌嗪均能提高大鼠血小板內cAMP的含量。速效救心丸能夠抑制多種誘導劑引起的血小板聚集，在本實驗中高劑量組對AA誘導的血小板聚集率顯示最強的抑制作用。

速效救心丸能夠抑制大鼠ADP、膠原和AA誘導的血小板聚集，其機制可能通過增加cAMP的含量而起到抑制血小板活化的作用。速效救心丸抑制血小板聚集作用呈現多環節、多靶點的特點，為其冠心病臨床治療提供了新的理論依據。

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(本文編輯王雅潔)

國家自然科學基金項目(No.8157364)；上海市中醫臨床重點實驗室(No.14D Z2273200)；上海市科委課題(No.14401972202)

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院(上海201203)；2.上海市浦東新區唐鎮社區衛生中心

王肖龍，E-mail：wxlqy0214@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.15.010

1672-1349(2016)15-1729-04

2016-04-22)