加味生脈補心丹對防治2型糖尿病大鼠心肌損害的影響

陳青揚，黃惠勇*，劉卜菡，曾光，潘繼興

（湖南中醫藥大學中醫診斷，湖南長沙410208）

·方藥研究·

加味生脈補心丹對防治2型糖尿病大鼠心肌損害的影響

陳青揚，黃惠勇*，劉卜菡，曾光，潘繼興

（湖南中醫藥大學中醫診斷，湖南長沙410208）

目的觀察加味生脈補心丹對2型糖尿病大鼠模型血糖及心肌組織結構的影響，初步探討加味生脈補心丹對糖尿病心肌纖維化和肥大的防治作用。方法40只SD大鼠隨機分為空白組7只，實驗組33只，通過高糖高脂飼料+小劑量STZ構建2型糖尿病大鼠模型。將成模后的實驗組大鼠隨機分為模型組、補心丹（BXD）組和羅格列酮（RSG）組各11只，BXD組以濃縮后加味生脈補心丹湯劑灌胃；RSG組按照羅格列酮鈉溶液灌胃。給藥8周后測各組大鼠空腹血糖，并處死取材，光鏡觀察心肌組織變化，Masson染色觀察纖維沉積情況，免疫組化法觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白和沉默信息調節因子3（Sirt3）蛋白的表達。結果成模時各實驗組空腹血糖（FPG）均較空白組升高（P＜0.05），造模成功。治療完成時，RSG組、BXD組FPG均較模型組下降（P＜0.05），RSG組FPG較BXD組更低（P＜0.05）。模型組心肌組織破壞嚴重，膠原纖維含量增多，RSG組和BXD組心肌組織破壞程度較輕，膠原纖維含量較少。模型組Ⅰ、Ⅲ型膠原和Sirt3的表達明顯高于其他組（P＜0.05）。BXD組Ⅲ型膠原的表達明顯高于空白組（P＜0.05）。RSG組Sirt3的表達顯著高于BXD組（P＜0.05）。結論加味生脈補心丹能夠明顯降低2型糖尿病大鼠的血糖，并能夠明顯減輕心肌纖維化、肥大的程度，延緩糖尿病所致心肌病的進程。

加味生脈補心丹；2型糖尿病；Ⅰ型膠原蛋白；Ⅲ型膠原蛋白；沉默信息調節因子3；心肌損害；太子參；黃芪

2型糖尿病是一種以胰島素抵抗為主的有多種并發癥的代謝性疾病，其中糖尿病心肌病是其主要并發癥之一，臨床表現以左室舒張（或）收縮功能障礙為主。心肌纖維化是糖尿病心肌病的重要特征性病理改變，隨著病情的進展會導致心功能減退、心臟擴大和各種心律失常。研究認為，膠原纖維的大量沉積是糖尿病心肌病心肌纖維化的重要致病因素[1]。膠原纖維在心肌細胞外基質的大量沉積將增加心室壁的僵硬度，減低心室的順應性從而導致心室的收縮與舒張功能不全。沉默信息調節因子3（Sirt3）能夠保護心肌細胞減少由于氧化應激導致的損傷，從而延緩心肌肥厚導致的心功能惡化的進程[2-3]。本文通過建立2型糖尿病大鼠模型，觀察大鼠心肌組織的病理改變、Masson染色改變以及Ⅰ、Ⅲ型膠原與Sirt3蛋白表達水平的改變，探討加味生脈補心丹在早期治療2型糖尿病的同時，對心肌組織的保護作用和預防作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物健康雄性SPF級SD大鼠，5周齡，40只，體質量（150±20）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCKX（湘）2011-0003。

1.1.2 飼料配方普通飼料：由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供。供給空白組。高糖高脂飼料配方如下：蔗糖15%，膽固醇4%，膽酸鈉0.3%，豬油10%，蛋黃粉10%，基礎膳食60.7%，混合、攪拌均勻，加水適量，塑形，烤箱烘干，由湖南中醫藥大學實驗動物中心加工。供給除空白組外的其他組。

1.1.3 藥物加味生脈補心丹：方劑來源于《內外傷辨惑論》卷中方和《攝生秘剖》卷一方加減：太子參10 g，丹參15 g，生地黃15 g，天花粉12 g，黃芪20 g，茯苓8 g，炙甘草6 g。飲片均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，加水煎煮2次，合并煎液，分別離心過濾，濃縮至含生藥2 g/mL，滅菌后于4℃冰箱保存備用。羅格列酮鈉片，規格4 mg/片，太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司。取羅格列酮研碎成粉末，溶于雙蒸水中。

1.1.4 主要試劑二步法試劑盒（中山金橋有限公司），DAB試劑盒（中山金橋有限公司），CollagenⅠ一抗（CST公司，貨號：14695-AP），CollagenⅢ一抗（Proteintech公司，貨號：135548-1-AP），Sirt3一抗（Abcam公司，貨號：10099-1-AP）。

1.2 方法

1.2.1 造模根據國內外常用2型糖尿病大鼠制備方法，即高糖高脂飼料+小劑量STZ誘導法改良的高糖高脂飼料+小劑量STZ體質量聯合體表面積法構建2型糖尿病大鼠模型[4]。將40只SD大鼠隨機分為7只空白組，33只實驗組，空白組給予普通飼料，實驗組予以高糖高脂飼料。所有大鼠均飼養于在自由飲食、分籠飼養，自由飲水飲食，溫度（20± 3）℃、背景噪音為（40±10）db、光/暗周期為12 h/ 12 h的條件下。喂養4周后，從第5周開始實驗組以mg/（kg+m2）法計算出的劑量腹腔注射STZ：體質量≤200 g的部分：按25 mg/kg計算STZ量；體質量＞200 g部分：按162.45 mg/m2[體表面積=大鼠體型系數（0.09）×體質量2/3]計算，二者相加即為1次STZ的注射劑量。間隔2 d后，再予以同樣的方法注射STZ。空白組則給予2次腹腔注射等容積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。最后一次注射STZ后的第6 d，禁食12 h尾端測空腹血糖，以2次空腹血糖＞11.1 mmol/L為2型糖尿病大鼠成模標準。

1.2.2 分組將造模成功的33只實驗組大鼠隨機分為：模型對照組（簡稱模型組）11只，羅格列酮鈉組（簡稱RSG組）11只，加味生脈補心丹組（簡稱BXD組）11只。

1.2.3 動物給藥造模成功后第2天，BXD組以濃縮后加味生脈補心丹湯劑10 mL/（kg·d）灌胃，相當于20 g/（kg·d）生藥；RSG組按照羅格列酮鈉溶液10 mL/（kg·d）予以灌胃。空白組和模型組每天以相同體積的生理鹽水灌胃。每天灌胃給藥1次，時間為9：00～11：00 a.m，持續給藥8周。

1.3 標本收集與指標檢測

1.3.1 外觀表征實驗期間觀察并記錄造模中各組大鼠體質量、進食量、尿量、毛發情況、活動及精神狀態、墊料、大便等一般指標。

1.3.2 空腹血糖檢測最后一次注射STZ后的第6 d，各組大鼠禁食12 h后，在非麻醉情況下剪尾取血測空腹血糖值，觀察藥物對大鼠空腹血糖的影響。

因此，電磁編碼器電路的輸出信號和碼盤的旋轉是緊密相連的。通過測定輸出信號的周期數或周期時間就可知道磁鼓的位置和旋轉速度。電磁旋轉編碼器結構示意如圖4所示。

1.3.3 心肌組織光鏡觀察各組大鼠，隔夜禁食12 h后稱重，分別進行斷尾釆血，即時測定空腹血

糖并予以記錄。隨后各組大鼠被腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）以麻醉。麻醉成功后，快速打開胸腔切除心臟，去除包膜，剪取心肌組織置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，經過脫水、包埋，制成切片，分別進行HE和Masson染色處理。封片后于光鏡下觀察心肌組織病理形態學改變及膠原沉積情況。

1.3.4 檢測膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ與Sirt3的表達將心肌組織切片通過免疫組化法分別作Ⅰ、Ⅲ型膠原以及Sirt3染色。經Image-Pro Plus圖像分析軟件隨機取3個視野分析光密度，判定1、3型膠原蛋白和Sirt3的表達。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠一般生存狀況

注射STZ后，與空白組相比，實驗組大鼠活動明顯減少，日平均消耗飼料量、飲水量、尿量增加，墊料氣味甜膩，毛發發黃、易脫落，精神萎靡，尾部潮濕。隨治療的進行，RSG組和BXD組大鼠一般狀況逐漸改善。實驗過程中，因灌胃損傷、炎癥等因素，模型組死亡1只，RSG組死亡1只。最后各組大鼠數目為：空白組7只，模型組10只，RSG組10只，BXD組11只。

2.2 大鼠空腹血糖變化情況

各組大鼠FPG檢測結果：實驗前各組大鼠血糖正常，各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。成模時，各實驗組FPG均升高（P＜0.05），達到糖尿病診斷標準。各實驗組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。治療完成時，各實驗組均較空白組升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。RSG組、BXD組均較模型組下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。RSG組FPG較BXD組更低，差異有統計學意義（P＜0.05）。說明羅格列酮和加味生脈補心丹均具有較好的降糖效果，其中加味生脈補心丹降糖效果略遜于羅格列酮。結果見表1。

2.3 心肌組織病理學改變與膠原沉積情況

大鼠心肌HE染色切片顯示，空白組心肌細胞排列整齊、核染色清晰。模型組心肌細胞肥大變性，排列紊亂，雖無明顯壞死灶，但部分細胞染色加深，橫紋消失，纖維腫脹。BXD組和RSG組心肌細胞亦不緊密，稍紊亂，核染色基本清晰，部分細胞染色不均勻，纖維腫脹，與模型組相比程度較輕。結果見圖1。

表1 各組各時期空腹血糖的比較（±s，mmol/L）

表1 各組各時期空腹血糖的比較（±s，mmol/L）

注：與空白組比較*P＜0.05，與模型組比較#P＜0.05，與BXD組比較△P＜0.05。

組別空白組模型組BXD組RSG組n 7 1 0 10 11 F P實驗前3.87±0.33 3.90±2.78 3.76±0.21 3.29±023 0.254 0.858成模時4.08±056 16.61±2.05* 17.68±2.53* 16.85±2.73* 49.349 0.00治療完成時3.86±0.39 11.61±0.85* 7.15±0.69*#5.24±1.15*#△77.824 0.00

圖1 各組大鼠心肌組織光鏡觀察圖（HE染色，×400）

Masson染色切片結果顯示，空白組膠原纖維網規則，膠原纖維含量少。模型組細胞間質纖維變粗、增加，圍繞心肌細胞的膠原纖維網斷裂、排列紊亂，間質纖維化明顯。BXD組和RSG組膠原組織排列較模型組規整，亦有不同程度纖維化，與模型組相比較輕。結果見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織光鏡觀察圖（Masson染色，×400）

2.4 Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白和Sirt3蛋白平均光密度結果

Ⅰ型膠原模型組明顯高于其他組，差異有統計學意義（P＜0.05）。RSG組、空白組、BXD組之間，差異無統計學意義（P＞0.05）。Ⅲ型膠原模型組與其他組，差異有統計學意義（P＜0.05）。RSG組與BXD組、空白組，差異無統計學意義（P＞0.05）。Sirt3模型組與其他組，差異有統計學意義（P＜0.05）。空白組與RSG組、BXD組，差異無統計學意義（P＞0.05）。RSG組與BXD組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達量（±s，g）

表2 各組大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達量（±s，g）

注：與空白組比較*P＜0.05，與模型組比較#P＜0.05，與BXD組比較△P＜0.05。

組別空白組模型組BXD組RSG組n 7 1 0 10 11 F P / /Ⅰ型膠原0.0074±0.0043 0.0611±0.0047* 0.0112±0.0032#0.0125±0.0033#4.229 0.013Ⅲ型膠原0.0088±0.0017 0.0300±0.0054* 0.0142±0.0038#0.0137±0.0037#11.511 0.00 Sirt3 0.0125±0.0033 0.0236±0.0049* 0.0101±0.0027#0.0165±0.0030#△5.501 0.04

3 討論

糖尿病在中醫學屬消渴病，最早記載于《黃帝內經》，是一種以多飲、多食、多尿、身體消瘦為主要臨床癥狀的慢性病。防治或延緩并發癥的發生是糖尿病的主要治療目標之一，與中醫“治未病”的理念相契合。加味生脈補心丹，由《內外傷辨惑論》卷中方生脈散和《攝生秘剖》卷一方補心丹兩方化裁而來，是湖南中醫藥大學第一附屬醫院應用十余年的經驗方[5]。本方心腎同治，陰陽兼顧，共奏滋陰清熱、補脾益氣、活血化瘀、升清降糖之功效。將此方應用于早期2型糖尿病及其心血管并發癥的防治也是中醫“治未病”思想的體現[6]。

本研究旨在探索加味生脈補心丹對2型糖尿病及其并發的早期心肌纖維化的影響。2型糖尿病的發病原因十分復雜，采用高糖高脂飼料喂養與腹腔注射STZ復合因素造模可以較好地模擬其病理機制。大劑量STZ可引起胰島細胞的廣泛破壞而造成1型糖尿病，而小劑量STZ破壞一部分胰島細胞的功能，配合高糖高脂飲食喂養下的依賴高胰島素水平狀態，造成外周組織對胰島素不敏感，從而引起糖尿病[7]。此方法與2型糖尿病發病機制相似，且接近人類2型糖尿病的生理和病理特點[8]。由實驗結果可見，加味生脈補心丹對糖尿病多飲、多食等癥狀均能起緩解作用，且有一定降糖效果，但不如羅格列酮。從光鏡下的HE、MASSON染色切片中可見本方對心肌有明顯的保護作用，纖維化程度明顯得到緩解。由Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達結果可知本方與羅格列酮均有的防心肌纖維化作用。其中羅格列酮主要是通過控制血糖來實現，而本方的降糖作用不如前者，卻有著與其相當的護心作用，有理由認為本方還有其他途徑達到這一效果。有研究認為心肌細胞肥大、運動與壓力的超負荷可造成Sirt3表達的代償性增高[9-10]。根據Sirt3蛋白表達結果，我們可以推測本方還可以通過改善心肌代謝達到護心、防纖維化的作用。

綜上所述，加味生脈補心丹對2型糖尿病大鼠有良好的降糖、護心作用。有可能是在降糖與改善心肌代謝的協同作用下實現延緩心肌纖維化效果。本實驗明確了加味生脈補心丹的療效，并為后續研究其作用機制開拓了思路。

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（本文編輯楊瑛）

Therapeutic Effect of Modified Shengmai Buxin Pills on the Myocardial Damage in Type 2 Diabetes Rats

CHEN Qingyang,HUANG Huiyong*,LIU Bohan,ZENG Guang,PAN Jixing
(Institute of TCM Diagnosis,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To observe the effect of modified Shengmai Buxin pills on the FPG and myocardial structure in type 2 diabetes rats，and preliminary investigate the therapeutic effect on myocardial fibrosis and hypertrophy.Methods 40 SD ratswererandomlydistributedintotheblankgroupwith7ratsandexperimentalgroupwith33rats.Thetype 2 diabetes models were established by feeding the animals with high-fat and high-sucrose diet.The establisged model rats in experimental group were randomly divided into the model group，Buxindan group（BXD）and rosiglitazone group（RSG）group，11 rats in each group.The BXD group was given concentrated modified Shengmai Buxindan decoction by gavage and the RSG group was with rosiglitazone sodium.After 8 weeks，FPG of rats was measured and excuted for heart sample.The changes of myocardial tissue were observed.The fibrous deposition was observed by masson method.The expression of collagen I/III and silent information regulator-3（Sirt3）was determined by immunohistochemical method.Results The FPG of experimentalgroupwashigherthannormalgroup（P＜0.05）.TheFPGofRSGgroupandBXDgroupwashigher than model group（P＜0.05）.The FPG of RSG group was lower than BXD group（P＜0.05）.The myocardial structure of model group was severely damaged and collagen fiber content increased obviously.The damage of the myocardial structure was slighter and the content of collagen was lower in RSG group and BXD group.Compared with the model group，the expression level of collagen I/III and SIRT3 were decreased significantly（P＜0.05）in the other groups.Compared with the normal group，the expression level of collagen III was increased significantly（P＜0.05）in the BXD group.The expression level of Sirt3 in RSG group was increased significantly than the RSG group（P＜0.05）.Conclusion The modified Shengmai Buxin pillscansignificantlydecreasethelevelofbloodsugarintype2diabetesrats.Itcanalleviatethedegree of myocardial fibrosis and hypertrophy，and delay the progression of diabetic cardiomyopathy.

modified Shengmai Buxin pills；type 2 diabetes；collagen I；collagen III；silent information regulator-3；myocardial damage；Radix Pseudostellariae；Astragalus membranaceus

R285.5；R587.1

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.03.002

2015-12-17

國家自然科學基金（81373551）；教育部博士點博士導師基金（2013432311001）；湖南省科技廳重點項目（S2014S2032）；中醫診斷國家重點學科開放基金（2013ZYZD04，2013ZYZD27，2014ZYZD05，2014ZYZD28）

陳青揚，男，在讀碩士研究生，研究方向：心血管疾病的中醫辨治。

黃惠勇，男，教授，博士研究生導師，E-mail：tony27000@aliyun.com。