盲腸結扎穿孔術法建立的膿毒癥大鼠動物模型不同臟器組織超微結構動態變化觀察

胡丹丹，楊國良，樓黎明

盲腸結扎穿孔術法建立的膿毒癥大鼠動物模型不同臟器組織超微結構動態變化觀察

胡丹丹，楊國良，樓黎明

目的觀察盲腸結扎穿孔術法（CLP）建立的膿毒癥大鼠動物模型心、肝、腎不同臟器組織超微結構的動態變化。方法雄性SD大鼠32只，隨機分為正常組、假手術組、模型6h組和模型24 h組，各8只。CLP建立膿毒癥大鼠動物模型，觀察各組大鼠心肌酶譜、肝腎功能的變化，同時通過透射電鏡觀察各組大鼠心肌細胞、肝細胞及腎小球超微結構改變。結果CLP術后6 h，模型組大鼠心肌細胞線粒體腫脹，部分肌纖維稀疏；肝細胞溶解，內質網減少，線粒體腫脹；腎小球結構未見明顯改變。至術后24 h，大部分心肌細胞出現自溶，偶見心肌細胞呈核固縮、核碎裂等壞死改變；肝細胞線粒體與內質網廣泛的空泡變性，細胞器模糊結構不清；腎小球基底膜部分增厚，部分足突細胞融合消失，腎小球塌陷等。結論膿毒癥大鼠早期就存在心、肝等多臟器損傷，腎損傷出現較晚。

盲腸結扎穿孔；膿毒癥；多臟器損傷

[Modern PracticalMedicine,2016,28(10):1271-1273]

膿毒癥具有發生率高、病死率高及治療費用高等特點，可導致多器官功能受損，包括急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、急性腎功能衰竭（ARF）、急性心力衰竭（AHF）、急性肝損傷、凝血功能紊亂、骨髓功能抑制、腦損傷以及酸堿平衡紊亂等，進而出現多器官功能障礙綜合征（MODS）。膿毒癥與其并發癥是重癥監護室患者首要的死因，占10%～50%[1-2]。本文以盲腸結扎穿孔術（CLP）法制備膿毒癥大鼠動物模型，通過動態觀察大鼠心、肝、腎等重要臟器超微結構的變化，以期探討膿毒癥臟器損傷的時間。報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物雄性SD大鼠32只，清潔級，體質量（200±20）g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供和飼養，許可證號：SYXK（浙）2013-0184。大鼠造模前在標準飼養條件下適應性喂養1周，術前24h禁食禁水。

1.2 主要儀器及試劑低溫離心機（Eppendorf Centrifuge 5804，德國）；Vortex-Genie 2旋渦混合器（SI美國）；AY220精密天平（SHIMADZU日本島津）；自動生化分析儀。2%戊巴比妥鈉（上海西塘生物科技有限公司），PBS原液。

1.3 方法

1.3.1 膿毒癥模型的制備采用CLP法建立膿毒癥大鼠動物模型[3]，100g/L水合氯醛按300mg/kg腹腔注射麻醉后固定，沿腹中線作2.0 cm切口，打開腹腔后小心分離盲腸，避免碰觸腸系膜血管，在盲腸根部結扎，在與腸系膜相對的盲端腸壁漿膜面用9號針頭穿刺2次，輕擠出少量內容物，還納盲腸于腹腔，關閉腹腔，逐層縫合，術后即刻予以皮下注射0.9%

氯化鈉注射液10m l/kg補充手術過程中丟失的體液。

1.3.2 分組及給藥將32只雄性SD大鼠分為正常組、假手術組、模型6h組和模型24h組，各8只。模型6 h組與模型24 h組行CLP術；假手術組麻醉后開腹翻動腸道，關腹；正常組與其余各組同步飼養。模型6 h組于CLP術后6 h麻醉，腹主動脈采血處死，其余各組于CLP術后24h麻醉，腹主動脈采血處死。

1.4 指標檢測

1.4.1 生化指標檢測各組術后檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、肌酸激酶（CK）及肌酸激酶同工酶（CK-MB），送檢浙江中醫藥大學附屬第三醫院檢驗科，使用自動生化分析儀測定。

1.4.2 心、肝、腎臟器組織透射電鏡樣品制備及觀察迅速切取1mm3大小的心肌、左腎腎門及肝左葉組織塊，保持低溫環境下2.5%戊二醛固定液固定2h以上，0.1M磷酸緩沖液充分洗滌；1%鋨酸后固定1.5 h，磷酸緩沖液清洗0.5 h；梯度酒精脫水；浸透；包埋。制作好包埋塊后，用超薄切片制刀機分割玻璃條，制成玻璃刀，并用橡皮膏制作水槽。然后在超薄切片機上進行超薄切片。首先1m半薄切片，天青藍染色，在光鏡下觀察定位，超薄切片，厚度80 nm，撈取切片在事先已做好支持膜的銅網上。超薄切片制作好后，檸檬酸鉛染色液染色12min，蒸餾水清洗三次后，自然晾干，透射電子顯微鏡下觀察。

1.5 統計方法數據采用SPSS 20.0軟件處理，計量資料以均數±標準差表示，采用F或q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生化指標變化比較各組生化指標差異均有統計學意義（≥5.69，均＜0.05），術后模型6 h及模型24 h ALT、AST、Cr、BUN、CK及CK-MB與假手術組比較，差異均有統計學意義（≥3.48，均＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠生化指標動態變化比較

2.2 各組不同臟器超微結構動態變化心肌超微結構：正常組及假手術組大鼠心肌細胞內肌絲、肌節結構清晰，排列整齊，線粒體排列整齊，肌原纖維結構正常。CLP術后6 h，心肌細胞線粒體腫脹，部分肌纖維稀疏。CLP術后24h，心肌細胞線粒體腫脹加重，部分空泡變性，大部分心肌細胞出現自溶，偶見心肌細胞呈核固縮、核碎裂、胞漿崩解等壞死改變。見封二彩圖3。

肝細胞超微結構：正常組及假手術組大鼠肝細胞形態規則，細胞漿中有豐富的線粒體、粗面內質網，線粒體嵴正常而清晰，細胞核清晰可見。CLP術后6 h，肝細胞內質網減少，線粒體腫脹，偶見肝細胞溶解。CLP術后24h，肝細胞胞漿出現部分溶解，線粒體與內質網廣泛的空泡變性，細胞器模糊結構不清，部分肝細胞可見核染色質固縮。見封二彩圖4。

腎小球超微結構：正常組及假手術組大鼠腎小球結構正常，基底膜完整，上皮細胞足突清晰，近曲小管和遠曲小管結構均正常，細胞連接清楚，絨毛存在，細胞器完整。CLP術后6h，超微結構未見明顯改變，偶見部分足突細胞變平。CLP術后24h，腎小球基底膜部分增厚，部分足突細胞融合消失；腎小球塌陷。見封二彩圖5。

3 討論

膿毒癥動物模型復制方法可分為細菌或內毒素攻擊模型和局部感染模型兩大類。內毒素攻擊模型可控性比較強，動物的反應性相對來說比較一致，但費用高。CLP模型屬局部感染造模方法，其原理是模擬人類闌尾炎或憩室炎穿孔的病例造成混合性細菌感染，壞死組織可成為炎癥反應來源，CLP模型在距離原發打擊一定時間后，各器官的生化指標均出現不同程度的異常改變，并伴有全身血流動力學改變和凝血系統功能異常，而細胞因子水平升高相對平緩，持續時間長[4]。這些特點與臨床患者實際情況相近，在局部感染模型上進行的抗炎藥物試驗取得的結果也與臨床相似。因此是目前公認的臨床相關性較強的膿毒癥動物模型。

眾所周知，膿毒癥可導致多器官損傷。膿毒癥合并心肌損傷是ICU非心源性死亡的主要原因，也是膿毒癥的常見并發癥。有數據表明，膿毒癥患者40%～50%可發生心肌抑制[5]，7%可發生心力衰竭[6]，其機制可能與炎癥因子對心肌的損傷[7]，心肌細胞鈣離子超載[8]，氧自由基損傷[9]，能量代謝障礙[10]等相關。腎臟血流量非常豐富，也是膿毒癥病程中受研究者重視的重要器官之一。膿毒癥、重度膿毒癥以及膿毒癥休克患者并伴發急性腎損傷(AKI)的概率逐漸增加，依次約為19%、23%和51%，若進展為急性腎功能衰竭(ARF)，病死率可高達70%左右[11-12]，倘若能早發現、早干預，就能顯著降低膿毒癥患者的病死率[13]。肝臟不僅是膿毒癥中最易受損的器官之一，還對膿毒癥的發生、發展有舉足輕重的作用，其結構、功能和代謝的變化影響著膿毒癥病情的發展。急性肝損傷可發生在膿毒癥的任何階段。早期肝功能障礙是膿毒癥死亡的一項獨立而實際的預警因素，超過傳統的循環、腎臟、中樞神經系統等死亡預警因素[14]。其發生機制與肝微循環與肝血流改變導致肝細胞缺血缺氧，肝細胞的能量代謝障礙，內毒素直接對庫普弗細胞的損傷作用等相關[15]。而對于心、肝、腎等臟器損傷在膿毒癥病程中出現的時間點鮮有報道。

本實驗中生化指標檢測提示：CLP術后6h，CKMB、CK、ALT、AST、BUN均出現不同程度的升高，與假手術組差異均有統計學意義（均P＜0.05）。至CLP術后24h，各項指標均顯著高于假手術組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），提示CLP大鼠早期即存在心肌損傷及肝功能損害，腎功能損傷不明顯，后期則多臟器功能受累。超微結構顯示表明，膿毒癥大鼠早期即存在心、肝等多臟器功能損傷，腎損傷出現較晚，隨著時間的延長，心、肝、腎等多臟器損傷，故膿毒癥治療的早期就應兼顧臟器功能的保護。

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Dynamicalchangesofultrastructuralorgans in septic ratmodelestablished by cecal ligation and perforation

HUDandan,YANGGuoliang,LOU Liming.(The Third A ffiliated Hospitalof Zhejiang TraditionalChineseMedicalUniversity,Hangzhou 310005,Zhejiang,China)

Objective To obersvedynamicalchangesofultrastructureofmajororgansin septic ratmodelestablished by cecal ligation and perforation(CLP),including heart,liverand kidney.Methods Thirty-twomale SD ratswere random ly divided into fourgroups:normalgroup,sham-operated group,6-hourmodelgroup and 24-hourmodelgroup.Therewereeightratsineachgroup.Thechangesofmyocardialenzymes,liverand kidney functionwereobserved. The ultrastructural changes ofmyocardial cells,hepatocytes and glomeruliwere observed by transm ission electron microscope.Results Six hoursafterCLP,them itochondriawereswollen and somemuscle fibersweresparse in the modelgroup;atthesame time,the livercelldissolved,them itochondrion of livercellgotswelling,and theendoplasmic reticulum of liver celldecreased;but theglomerularstructure did notchangeobviously.Twenty-fourhoursafter CLP,mostof the cardiomyocytes showed autolysis,and occasionally necrotic changessuch asnuclear pyknosisand nuclear fragmentationwereobserved.Thevacuolardegeneration ofmitochondriaand endoplasmic reticulumin liver cellsand theunclearstructureoforganelleswereunclear.Thebasilarmembraneof renalglomerulus partly gotthick, and footprocesscell fused and disappeared.Conclusions Rats with sepsishad earlymultipleorgan injury,including heartand liver,while kidneywasdamaged later.

Cecal ligation and perforation；Sepsis；Multiple organ injury

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.10.004

R574.61；R632.5

A

1671-0800(2016)10-1271-03

2016-03-14

（本文編輯：鐘美春）

浙江省自然科學基金（LY12H15004，LQ12H27006）；浙江省中醫藥科技計劃（2012ZB069）；浙江中醫藥大學附屬第三醫院重點項目（ZS10ZA04）

310005杭州，浙江中醫藥大學附屬第三醫院（胡丹丹、樓黎明）；浙江省中西醫結合醫院（楊國良）

樓黎明，Email：llm2348@163.com