關嶺黃牛ANGPTL4基因多態性與生長性狀關聯分析

徐龍鑫+劉鏡+張麟+何光中

摘要：為研究牛血管生成素樣蛋白4（angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4）在調節脂肪和能量代謝中的作用，采用DNA測序技術，對關嶺黃牛92頭個體ANGPTL4基因的多態性進行研究，分析多態性位點與關嶺黃牛生長性狀的相關性。結果表明，在擴增片段為752 bp的產物中，發現387 C>T、418 C>T、449 A>T等3個突變位點，3個突變位點均處于哈代-溫伯格不平衡狀態（HWE）（P<0.05），3個多態位點的多肽信息含量（PIC）均為中度多態。相關性檢測結果表明，418 C>T突變位點不同基因型關嶺黃牛的體高、體斜長、胸圍、腹圍表現出差異極顯著（P<0.01），449A>T突變位點不同基因型關嶺黃牛的體高表現出差異顯著（P<0.05），胸圍、腹圍表現出差異極顯著（P<0.01）。

關鍵詞：關嶺黃牛；ANGPTL4基因；多態性；關聯分析

中圖分類號： S823.8+12 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0051-02

血管生成素相關蛋白4（angiopoietin-related protein 4，ANGPTL4）是與血管生成、脂類代謝、葡萄糖代謝、胰島素敏感性密切相關的分泌性蛋白質因子[1-3]，并與TGFβ信號通道直接關聯，在腫瘤細胞的惡性轉移過程中起著關鍵作用[4]?，F有研究表明，類血管生成素4除了在血管發生方面同血管生成素（ANGPTL）相似的作用外，它還可以抑制脂蛋白脂肪酶的活性同時正調控血漿甘油三脂水平[5-6]，促進脂肪動員，抑制脂肪貯存[7]。它是調控脂類分化和葡萄糖代謝動平衡的核受體，因此，ANGPTL4基因可能在脂類代謝和葡萄糖代謝動平衡的調控方面發揮作用[8-9]。

目前，在人和鼠上對ANGPTL4基因的研究報道較多，但是家畜該基因的研究報道較少。馬云克隆了牛的ANGPTL4基因的CDS序列和部分DNA序列，運用測序和PCR-SSCP相結合的方法對該基因的部分基因組DNA片段進行單核苷酸多態性檢測[10]，同時運用一般線性模式研究ANGPTL4基因與8個品種牛肉質性狀的相關性，結果表明，牛ANGPTL4基因的遺傳變異與牛育肥后肌內脂肪含量存在密切關系。研究ANGPTL4基因的結構和功能，剖析其影響牛肌間脂肪含量的分子機制，有助于實現肌間脂肪含量性狀的遺傳改良。

本研究采用直接測序方法，以貴州關嶺黃牛為對象，研究ANGPTL4基因的多態性，同時與關嶺黃牛生長性狀進行關聯分析，旨在尋找牛ANGPTL4基因與代謝調控的關系，尋找黃牛與生長性狀有關的分子標記，為貴州黃牛標記輔助育種提供基礎資料，為提高貴州黃牛的生長性能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

92頭關嶺黃牛全血樣采自貴州省關嶺縣種群核心保種區。采取的黃牛全血樣肝素抗凝，放入冰盒中帶回實驗室-80 ℃ 保存備用。在采樣的同時，對各個體的生長性狀、體長數據進行測定。

1.2 基因組DNA的提取

采用蛋白酶K和TaKaRa Blood Genome DNA Ex-traction Kit（購于北京天根生物公司）提取基因組DNA。

1.3 引物設計和PCR擴增

根據在GenBank 中登錄的牛ANGPTL4基因序列（GenBank登錄號為NC 007305.4），使用引物設計軟件PrimerPremier 5.0設計1對引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列信息見表1。

PCR反應體系為20 μL，其中2×Taq PCR Master Mix10 μL，購于北京天根生物公司；上下游引物各1 μL；DNA 模板2 μL；ddH2O 6 μL。PCR 反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存備用。

1.4 PCR產物的測序

將PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收擴增片段，送生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.5 數據統計與分析

用DNAstart軟件包中的SeqMan對測序所得的序列進行校對，用Clustalx程序進行同源性比對。基因型頻率、等位基因頻率、雜合度等群體遺傳參數采用Popgene生物技術軟件處理。運用SPSS 13.0分析生長性能數據及關聯性。

2 結果與分析

2.1 ANGPTL4基因SNP檢測

由圖1可見，關嶺黃牛ANGPTL4基因PCR擴增片段長度為752 bp，經測序檢測發現，387 C>T、418 C>T、449 A>T等3個突變位點均存在2種基因型。

2.2 關嶺黃牛ANGPTL4基因多態性分析

由表2可見，3個變異位點均是雜合子基因型為優勢基因型。387 C>T變異位點C等位基因頻率小于T等位基因，418 C>T變異位點C等位基因頻率大于T等位基因，449A>T變異位點A等位基因頻率大于T等位基因。HWE檢測結果表明，3個變異位點均處于HWE不平衡狀態（P<0.05）。3個變異位點的雜合度 （He） 介于0.441 9～0.492 7之間，有效等位基因（Ne）介于1.784 1～1.960 8之間，多態信息含量（PIC）均呈現中度多態。

2.3 關嶺黃牛ANGPTL4基因多態位點與生長性狀關聯性分析

如表3所示，將關嶺黃牛ANGPTL4基因多態位點與關嶺黃牛體高、體斜長、胸圍、腹圍、管圍、十字部高、坐骨端寬 7個生長性狀指標進行關聯性分析，418 C>T變異位點CT基因型個體體高、體斜長、胸圍、腹圍極顯著大于CC基因型；449 A>T變異位點AA基因型個體體高顯著大于AT基因型，胸圍、腹圍極顯著大于AT基因型。

3 結論與討論

候選基因法是一種尋找畜禽重要經濟性狀遺傳標記的常用方法，它可以直接研究該基因多態性與個體經濟性狀的關系。本研究通過測序方法對關嶺黃牛的ANGPTL4基因進行多態性分析，并與生長性狀進行關聯性分析。結果發現，3個變異位點均具有2種基因型。從進化角度看，群體中的遺傳多樣性是歷史的產物[11]，多態性信息含量和雜合度都是群體內遺傳變異的重要度量指標，雜合度值越大，群體內的遺傳變異就越大。多態信息含量值衡量基因變異程度高低，Botstein等提出衡量基因變異程度高低的多態信息含量指標，當PIC>0.5 時，該變異位點為高度多態；當0.25

ANGPTL4蛋白是一種具有廣泛生理功能的物質，尤其對脂代謝的調控具有重要作用，脂代謝影響肉質的嫩度、風味和多汁性，脂肪性狀是衡量肉質的重要指標之一。因此，研究ANGPTL4基因的突變對對牛生長發育的影響具有重要的理論和實踐意義。本研究中發現，418 C>T變異位點CT基因型個體體高、體斜長、胸圍、腹圍極顯著大于CC基因型；449 A>T變異位點AA基因型個體體高顯著大于AT基因型，胸圍、腹圍極顯著大于AT基因型。因此，ANGPTL4基因完全可以作為牛生長性狀的潛在遺傳標記，為貴州黃牛肉用性能分子育種提供理論依據。

參考文獻：

[1]Hato T，Tabata M，Oike Y. The role of angiopoietin-like proteins in angiogenesis and metabolism[J]. Trends in Cardiovascular Medicine， 2008，18（1）：6-14.

[2]Adachi H，Fujiwara Y，Kondo T，et al. Angptl 4 deficiency improves lipid metabolism，suppresses foam cell formation and protects against atherosclerosis[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，379（4）：806-811.

[3]Aronsson L，Huang Y，Parini P，et al. Decreased fat storage byLactobacillus paracasei is associated with increased levels of angiopoietin-like 4 protein （ANGPTL4）[J]. PLOS One，2010，5（9）：13087.

[4]Kaddatz K，Adhikary T，Finkernagel F，et al. Transcriptional profiling identifies functional interactions of TGF β and PPAR β/δ signaling：synergistic induction of angptl 4 transcription[J]. The Journal ofBiological Chemistry，2010，285（38）：29469-29479.

[5]Sukonina V，Lookene A，Olivecrona T，et al. Angiopoietin-likeprotein 4 converts lipoprotein lipase to inactive monomers and modulates lipase activity in adipose tissue[J]. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，2006，103（46）：17450-17455.

[6]Lichtenstein L，Berbée J F，van Dijk S J，et al. Angptl 4 upregulates cholesterol synthesis in liver via inhibition of LPL-and HL-dependent hepatic cholesterol uptake[J]. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology，2007，27（11）：2420-2427.

[7]朱洪新，李錦軍，覃文新，等. 新基因ANGPTL4的克隆及其在血管新生中的功能研究[J]. 中華醫學雜志，2002，82（2）：94-99.

[8]Kster A，Chao Y B，Mosior M，et al. Transgenic angiopoietin-like （angptl）4 overexpression and targeted disruption of angptl4 andangptl3：regulation of triglyceride metabolism[J]. Endocrinology，2005，146（11）：4943-4950.

[9]Xu A，Lam M C，Chan K W，et al. Angiopoietin-like protein 4decreases blood glucose and improves glucose tolerance but induceshyperlipidemia and hepatic steatosis in mice[J]. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（17）：6086-6091.

[10]馬 云. 牛三個基因的分離、定位及其牛經濟性狀的關聯研究[D]. 楊凌：西北農業科技大學，2006.

[11]Nei M，Tajima F，Tateno Y. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data[J]. Journal of Molecular Evolution，1983，19（2）：153-170.

[12]Valizadeh M，Kang K K，Kanno A，et al. Analysis of genetic distance among nine Medicago species by using DNA polymorphisms[J]. Breeding Science，1996，46（1）：7-10.